17β－雌二醇对去卵巢大鼠子宫β－连环素和E－钙粘素蛋白表达的影响

陈永杰，卜淑敏，沈红

(1.北京农学院动物科学系，北京 102206;2.首都体育学院，北京 100080)

研究报告

17β－雌二醇对去卵巢大鼠子宫β－连环素和E－钙粘素蛋白表达的影响

陈永杰1，卜淑敏2，沈红1

(1.北京农学院动物科学系，北京 102206;2.首都体育学院，北京 100080)

目的旨在研究17β－雌二醇对去卵巢大鼠子宫β－连环素(β－catenin)和E－钙粘素(E－cadherin)蛋白表达的影响。方法将30只健康3月龄雌性SD大鼠，随机分为假手术组、去卵巢组、去卵巢和雌激素给药组。大鼠去卵巢1周后，给药组大鼠颈部皮下注射17β－雌二醇，每周3次，每次50 μg/(kg·bw)，连续给药10周。采用放免法、免疫组化法和Western blot方法分别检测大鼠血清E2水平、子宫β－catenin和E－cadherin蛋白的免疫定位和表达。结果大鼠去卵巢后子宫指数和血清E2水平显著下降，但大鼠补充外源性17β－雌二醇后，上述两项指标均显著回升且与假手术组相比无显著差异。免疫组化检测发现，假手术组和去卵巢组大鼠子宫内膜的细胞膜上有β－catenin和E－cadherin蛋白表达，而雌激素给药组大鼠子宫内膜细胞膜和细胞核上都有E－cadherin表达。Western blotting结果进一步显示，去卵巢组大鼠子宫β－catenin和E－cadherin蛋白表达量极显著低于假手术组和雌激素给药组。结论17β－雌二醇不仅能使E－cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宫细胞中的免疫定位发生变化，而且还能刺激βcatenin和E－cadherin蛋白的表达。

雌二醇;去卵巢大鼠;β－连环素;E－钙粘素

女性在绝经期由于卵巢功能衰退易出现肥胖、脂肪肝、冠心病、高血压、糖尿病、骨质疏松症等疾病，称为绝经期综合征。绝经期综合征是困扰当今社会的一大医学问题，目前临床上常用雌激素替代疗法(HRT)，即通过直接补充雌激素(estrogen，E2)来治疗此病症。该法虽然疗效确切，但如果长期服用，会出现较大的副作用，如增加阴道出血和促进生殖系统肿瘤发生等［1］，无法在临床上广泛应用和推广。E2对子宫内膜增殖作用及致肿瘤作用的确切机制目前还不清楚，揭示E2介导的肿瘤发生途径，有助于从根本上解决E2的潜在致癌作用。E－钙粘素(E－cadherin)是一种Ca2+依赖性细胞粘附分子，广泛分布于上皮细胞，是维持上皮细胞极性及细胞间粘附、连接的主要分子。β－连环素(β－catenin)是细胞骨架蛋白和Wnt信号通路转导分子之一，在细胞连接处它与E－cadherin结合形成E－cad－cat复合体相互作用，参与细胞粘附，维持上皮细胞的正常形态，而游离的β－catenin可进入细胞核，调节基因表达［2，3］。许多研究表明，肿瘤的发生发展过程中常常伴有异常Wnt信号的激活，E－cadherin表达异常常与肿瘤的发生、转移及预后有关［4］。为此，本实验采用国内外通用的模拟绝经后综合征的去卵巢大鼠模型［5］，检测了补充外源性17β－雌二醇对去卵巢大鼠子宫β－catenin和E－cadherin蛋白表达的影响，旨在为探讨绝经后妇女长期服用E2继发子宫内膜癌的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

17 β－estradiol(E2，Sigma E 2758－5G)，多聚甲醛(Merck，德国)，石蜡(上海华永石蜡有限公司)，兔源β－catenin多克隆抗体(RB－1491－P0 NeoMarkers Biotechnology，Fremont，)、兔源E－cadherin多克隆抗体(H－108，SC－7870)，生物素标记的山羊抗兔二抗、辣根酶标记卵磷蛋白素、山羊抗兔IgG/碱磷酶标记抗体(ZB－2308中杉金桥生物技术有限公司)、rabbit－anti－actin(SC－1616R中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒和碱磷酶底物BCIP/NBT显色浓缩液(中杉金桥生物技术有限公司)，橄榄油(PONS)，E2试剂盒(中国原子能科学研究院)， RIPA蛋白裂解液(P0013B碧云天)，SDS－PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015碧云天)。Leica切片机(Leica，德国)，显微镜(Olympus BX51)，电泳仪(DYY－7C型北京六一仪器厂)。

1.2 实验动物分组和处理

三月龄未经产Sprague Daw ley雌性大鼠30只，体重(230±15)g，购自并饲养在维通利华实验动物有限公司［SCXK(京)2006－0008］。大鼠在通风无菌环境下自由采食与饮水，饲养7d后，按体重随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)和E2给药组(OVX+E2)，每组10只动物。去卵巢和E2给药两组大鼠均摘除双侧卵巢，假手术组仅切除卵巢附近少许脂肪。无菌手术在北京大学医学部实验动物科学部进行［SYXK(京)2006－0025］，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。手术1周后，E2组大鼠每周按体重颈部皮下注射3次17 β－雌二醇，每次50 μg/(kg·bw)，连续注射10周。每周称一次体重，按体重调整给药剂量，假手术和去卵巢组大鼠同时给予相同体积的溶剂(无水乙醇和橄榄油)。

1.3 取材

实验结束时，大鼠禁食12 h，按体重腹腔注射水合氯醛(0.1 m l/kg)麻醉，腹主动脉取血后处死，剪开腹腔，游离子宫，仔细剪去子宫周围脂肪组织，称重，计为子宫湿重，子宫指数=子宫湿重(mg)/体重(g)。迅速将左侧子宫投入4%多聚甲醛溶液中固定，将右侧子宫液氮冻存以备蛋白提取。

1.4 血清E2含量的测定

常规方法制备血清后，－40℃保存。用放射免疫法测定大鼠血清E2含量，实验操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组织化学分析

子宫石蜡连续切片(5 μm)经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、抗原修复、3%双氧水处理后，用山羊血清封闭1 h，加一抗(β－catenin，E－cadherin)，4℃过夜;PBS洗3次，每次5 min;加生物素标记的山羊抗兔IgG室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 m in，加辣根酶标记卵磷蛋白素室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，DAB显色。切片经苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后，Olympus显微镜下观察拍照。

1.6 W estern b lotting测定分析

取200 mg子宫组织在液氮中研成粉末，加入1 m L组织裂解液，研磨后静置于冰上2 h，4℃12 000 r/m in离心30 m in，取上清，留一部分检测蛋白质浓度，其余蛋白样品与SDS－PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水煮5 m in，分装后－40℃保存。

取蛋白样品40 μg，上样，以80 V电压，在10%的SDS－PAGE中分离约2 h后，以80 V电压2 h，转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PVDF膜用一抗(β－catenin，E－cadherin，β－actin)孵育4℃过夜，次日，室温作用2 h，加二抗(山羊抗兔Ig/ G碱磷酶标记)室温孵育2 h，碱磷酶底物BCIP/ NBT显色浓缩液作用PVDF膜显色直至条带出现，放入水中终止显色，扫描各条带灰度。

1.7 数据分析

采用SPSS16.0统计软件处理数据，实验结果以平均数±标准差(±s)表示，组间差异显著性采用方差分析的LSD(ONE WAY－ANOVA)。

2 结果

2.1 大鼠子宫重量及子宫指数的分析

各组大鼠子宫湿重和子宫指数统计分析结果见图1。由图1可知，去卵巢组大鼠子宫湿重和子宫指数极显著低于假手术组和E2组(P＜0.01)，E2组大鼠子宫湿重显著低于假手术组(P＜0.05)，但两组大鼠子宫指数差异无显著性。

图1 各组大鼠子宫湿重和子宫指数的分析Fig.1 Analysis of the uterus wet weight and uterus index of the rats in different groups

2.2 大鼠血清E2含量的分析

3组大鼠血清E2测量结果见图2，与假手术组相比，去卵巢大鼠血清E2含量极显著下降(P＜0.01)，E2给药10周后，E2组大鼠血清E2含量极显著升高(P＜0.01)，与假手术组相比没有显著性差异。

2.3 大鼠子宫β-catenin蛋白的表达

采用免疫组化法检测β－catenin蛋白在大鼠子宫中的表达，结果见图3(彩插5)。由图3可见，各组大鼠子宫内膜腔上皮、腺上皮、间质以及肌层中均有棕色β－catenin阳性表达产物，其中假手术组和去卵巢组大鼠子宫内膜细胞膜棕色明显，细胞核呈蓝色，没有β－catenin蛋白表达;而E2组大鼠子宫内膜细胞膜和细胞质棕色均增强，细胞核蓝色变浅并稍有棕色，说明β－catenin蛋白在细胞核也有表达(图3h和i)。

Western blotting结果进一步显示(图4)，去卵巢组大鼠子宫β－catenin蛋白表达量比假手术组极明显降低(P＜0.01)，而E2组大鼠子宫β－catenin表达量比去卵巢组极显著增加(P＜0.01)，且与假手术组没有显著差异。

图2 各组大鼠血清E2含量的分析(**P＜0.01)Fig.2 Analysis of serum E2concentration of the rats in different groups

2.4 大鼠子宫E-cadherin蛋白的表达

图4 大鼠子宫β－catenin和内参β－actin的免疫印迹结果(A)和蛋白的相对表达水平(B)(**P＜0.01)Fig.4 The results of Western blotting of β－catenin and β－actin protein(A)and the relative expression levels of β－catenin(B)and β－catenin protein(B)in the rat uterine tissue

E－cadherin蛋白在大鼠子宫的免疫定位结果如图5(彩插5)所示。由图5可见，棕色为阳性表达产物，假手术组中，E－cadherin蛋白主要在子宫内膜腺上皮和腔上皮的细胞膜上表达，细胞核中不表达，基质细胞中只有背景水平的表达。E2组中，E－cadherin在基质和肌层中的表达增强，且定位发生变化，不仅细胞膜表达，细胞核也有表达(图5h和i)。

Western blotting结果进一步显示(如图6所示)，去卵巢组大鼠子宫E－cadherin蛋白表达量极显著低于假手术组(P＜0.01)，而E2组大鼠子宫E－cadherin蛋白表达量比去卵巢组明显升高(P＜0.01)，与假手术组没有显著差异。

图6 大鼠子宫E－cadherin和内参β－actin的免疫印迹结果(A)和E－cadherin蛋白的相对表达水平(B) (**P＜0.01)Fig.6 The results of Western blotting of E－cadherin and β－actin proteins(A)and relative expression level of E－cadherin(B)in the rat uterine tissue.

3 讨论

E2被广泛用于防治绝经期综合征，但长期持续E2作用可增加患子宫内膜癌的风险。去卵巢动物模型是一种能够较好地模拟人类因E2不足而导致绝经期综合征发生的动物模型。本实验中，大鼠去卵巢后血清E2水平和子宫指数均显著下降，补充外源性E2后，血清E2水平和子宫指数明显回升且接近假手术组，提示本实验补充的外源性E2接近大鼠的生理剂量，能使子宫指数几乎恢复至正常水平。推测本实验采用的E2注射剂量应该不会导致去卵巢大鼠子宫内膜癌的发生。

β－catenin有双重作用，一方面作为Wnt/βcatenin信号通路的关键分子，游离在细胞质，当有Wnt信号时，β－catenin不能被降解复合物(APCGSK3β－Axin)及时降解，使胞质游离β－catenin水平升高，并转运到细胞核里与Tcf结合时，调节靶癌基因c－myc过度表达，导致细胞癌变［6］。另一方面，βcatenin在细胞膜上能与E－cadherin结合形成E－cadcat复合体，发挥细胞粘附作用，当E－cadherin突变时，可能使细胞质中游离的β－catenin水平升高，激活靶基因(如致癌基因等)［7］。

Hou等［8］研究认为Wnt/β－catenin信号通路在E2介导的子宫生长中起关键作用，是E2发挥ER非依赖性效应的主要作用途径，E2通过上调Wnt信号通路中Wnt4，Wnt5a和Fz2几个分子的表达，启动Wnt/β－catenin信号通路，使β－catenin迅速聚积到核里，启动下游基因表达。谢伟等［9］在体外观察了E2对子宫内膜异位症患者的子宫内膜间质细胞βcatenin表达的影响，发现E2能剂量和时间依赖性地促进子宫内膜间质细胞β－catenin mRNA和蛋白的表达。本实验中，E2能够使去卵巢大鼠子宫部分β－catenin蛋白内聚到腔上皮和腺上皮细胞的细胞质和细胞核中，提示β－catenin可能参与E2调节子宫腔上皮和腺上皮增殖的过程，此结果与Hou等的结果相符。Western bolt结果进一步显示去卵巢后β－catenin蛋白表达显著降低，给予雌激素治疗后，与去卵巢组相比β－catenin蛋白表达显著升高，表明E2能上调去卵巢大鼠子宫β－catenin蛋白的表达。说明能E2可能是通过激活Wnt/β－catenin信号通路而持续刺激子宫内膜的增殖。

E－cadherin是表达于所有正常上皮组织细胞膜上的一种代表性钙粘附素分子，属于钙依赖性跨膜糖蛋白，主要介导细胞间同质粘附，维持上皮细胞形态结构完整性和极性。近年来在肿瘤细胞侵袭和转移研究中发现，肿瘤细胞必须首先从邻近的肿瘤细胞中分离，再侵入周围组织，因此，细胞间粘附的丧失是肿瘤侵袭、发展和转移的关键步骤之一［10］。E－cadherin的功能障碍或缺失会使肿瘤细胞间的连接减弱，瘤细胞易于从母体脱离，发生转移;研究发现E－cadherin的表达程度与多种恶性肿瘤的肿瘤临床分级呈负相关，E－cadherin表达下调或缺失预示肿瘤转移及预后不良［11］。本实验结果表明E2能使E－cadherin在子宫内膜的表达出现定位变化，由细胞膜转移至细胞核，说明补充E2使E－cadherin失去正常膜定位，导致细胞粘附功能降低或消失。Western blotting结果进一步显示，去卵巢大鼠子宫E－cadherin蛋白表达显著降低，但补充E2后E－cadherin蛋白表达显著升高，提示E2能上调去卵巢大鼠子宫E－cadherin蛋白的表达。

正常情况下β－catenin与E－cadherin的结合会增加其在细胞质中的稳定性而避免被水解，同时也使β－catenin呈现稳定的膜表达，当E－cadherin表达下降或缺失时，β－catenin便会在胞质内积累，Wnt信号通路激活的阈值随之下调;反之E－cadherin在细胞膜上的稳定在一定程度上也依赖于与β－catenin的结合［12］，β－catenin与E－cadherin两者相互影响，与肿瘤发生、发展关系密切。长期持续无孕激素拮抗的高E2作用可能激活Wnt信号通路，使细胞膜上的β－catenin进入细胞核内，激活靶基因转录，使子宫不断的处于增殖中，同时引起E－cadherin的表达异常，导致细胞粘附功能降低或消失，有可能进一步引起肿瘤的发生。

17β－雌二醇不仅能使E－cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宫细胞中的免疫定位发生变化，而且还能刺激β－catenin和E－cadherin蛋白的表达。

(本文图3，5见彩插5。)

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Effects of 17β-Estradiol on the Exp ression of β-Catenin and E-Cadherin Proteins in the Uterus of Ovariectom ized Rats

CHEN Yong－jie1，BO Shu－m in2，SHEN Hong1
(1.Department of Animal Science and Technology;Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China; 2.Capital Institute of Physical Education，Beijing 100080，China)

ObjectiveTo study the effects of 17β－estradiol on the protein expression of β－catenin and E－cadherin in the uterus of ovariectomized rats.M ethods Three－month－old female Sprague－Dawley rats were random ly divided into three groups:sham－operation group，ovariectom ized group and estradiol group.17β－estradiol was injected subcutaneously three times a week at a concentration of 50 μg/kg for 10 weeks.The serum estradiol levels were determ ined by RIA，and the immunolocalization and content of β－catenin and E－cadherin proteins were detected by immunohistochemistry and Western blotting，respectively.ResultsThe uterus weight index and serum E2level were decreased in ovariectomized rats，and the decrease could be reversed by injection of estradiol.As a result，there was no significant difference between the sham－operation group and estradiol group.In the sham and ovariectomized groups，the positive immunoreactivity of βcatenin and E－cadherin proteins were present only in endometrial cell membrane.However，the positive immunoreactivity of E－cadherin protein was not only present in the cell membrane，but also was in cell nuclei in the estradiol group.The results of Western blotting further indicated that the content of β－catenin and E－cadherin proteins were significantly decreased in ovariectomized group compared with the sham－operation group and estradiol group.ConlusionThese results indicate that 17β－estradiol not only regulates the immunolocalization of E－cadherin protein in the uterus in ovariectomized rats，but alsostimulates the expression of β－catenin and E－cadherin proteins.

Estradiol;Ovariectomized rats;β－catenin;E－cadherin

R271.116

A

1005－4847(2010)02－0122－05

2009－08－19

国家自然科学基金资助(编号:30771046);北京市教委资助项目(KM200770029001，KM200910020006)。

陈永杰(1983－)，男，硕士研究生，研究方向:兽医药理学E－mail:chenyongjie83@163.com

沈红，副教授，E－mail:shenhong912@sina.com