复健片对大鼠脑梗死后不同时间点Nogo－A表达的影响

胡怀强，周永红，马学盛，王新陆

(1.中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南 250031;2.青岛大学医学院，青岛 266071; 3.山东中医药大学，济南 250355)

研究报告

复健片对大鼠脑梗死后不同时间点Nogo－A表达的影响

胡怀强1，周永红2，马学盛3，王新陆3

(1.中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南 250031;2.青岛大学医学院，青岛 266071; 3.山东中医药大学，济南 250355)

目的观察复健片在不同时间点对脑梗死大鼠脑组织Nogo－A表达的影响，探讨其促进神经发生的作用机制。方法240只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和药物组共四个大组，并根据脑梗死病程每组又分为3 d、1周、2周、4周、6周共5个亚组，每个亚组动物数为12只。用改良的Longa EZ法制备大脑中动脉阻塞大鼠模型，药物组灌胃给予复健片水溶液，余各组分别灌胃给予同剂量的蒸馏水。用免疫组织化学法观察模型大鼠梗死周边区脑组织Nogo－A的表达。结果模型组大鼠脑内的Nogo－A在梗死后即开始表达，逐渐增高，2周时达到高峰，第6周时还处于高表达状态，明显高于正常对照组。3 d时药物组中Nogo－A的表达与模型组比较差异无显著性(P＞0.05)，其余各药物组中Nogo－A表达与模型组比较均有非常显著性差异(P＜0.01)。结论复健片可抑制Nogo－A的表达，从而促进神经再生。

复健片;脑梗死;神经再生;抑制因子;Nogo－A

脑梗死后神经功能重塑的因素十分复杂，包括促进因素和抑制因素，能否有效解除抑制效应是中枢神经再生的关键［1］。Nogo－A是目前发现的最为强烈的神经纤维再生抑制物质，抑制损伤神经发生，尤其是再生神经纤维的长距离生长［2］。研究表明［3］，滋补肝肾的中药复健片可明显改善中风患者神经功能评分，可促进中枢神经再生作用，本研究首次通过给予复健片，观察局灶性脑缺血模型大鼠不同时间点脑组织中Nogo－A含量的变化，探讨复健片在脑梗死后脑功能重塑中的作用机制。

1 材料方法

1.1 动物和分组

成年SPF级雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠240只，体重250～300 g，由山东中医药大学实验动物中心提供［SCXK(鲁)20050015］，并于本动物中心动物实验设施进行无菌手术，检疫后备用，自由摄食进水。颗粒大鼠饲料，由济南康大饲料与山东省实验动物中心联合生产［鲁饲准字364号］。动物管理严格按照中华人民共和国科技部实验动物管理规范，使用的3R原则给予人道的关怀。大鼠随机分为:正常对照组、假手术组、模型组和药物组共四个大组，并根据脑梗死病程每组又分为3 d、1周、2周、4周、6周共5个亚组，每个亚组动物数为12只。

1.2 药物与试剂

复健片，主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等，由山东鲁信药业有限公司生产，批号: 2007030701，并按照成人剂量的20倍［9 g/(kg·d)］将其制成水溶液，浓度为0.9 g/m L(即1 mL/100 g)，置于4℃冰箱中备用。Nogo－A单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 大脑中动脉阻塞(M CAO)模型的制备

在Longa等［4］报道的方法基础上改良后行MCAO术制作局灶性脑缺血模型。MCAO模型成功的判断标准采用Longa EZ评分标准［4］:0分，无神经缺损表现;1分，对侧前爪不能充分伸展;2分，向外侧转圈;3分，行走时向对侧倾倒;4分，不能行走，意识丧失。动物清醒后进行神经功能评分，1至3分者为纳入标准，0分和4分者剔除。

1.4 给药方法

于造模成功24 h后给药，药物组灌胃给予复健片水溶液1 m L/100 g，余各对照组分别灌胃给予1 m L/100 g剂量的蒸馏水，每日1次，每周连续给药6 d，停1 d，并于取材当天停药。固体饲料和水自由摄取。各组均是每天给药1次，每3 d称体重1次，重新计算每只动物药量，直至取材时。

1.5 标本制备

在取材的各时间点，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PBS灌注固定取脑，然后将其浸于4%多聚甲醛中后固定。常规脱水浸蜡包埋，予正中隆起水平在切片机上行4 μm连续冠状切片。

1.6 免疫组织化学染色

切片常规脱蜡至水;30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次;热修复抗原:将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，电炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复1次，自然冷却后用PBS(pH 7.2～7.6)洗涤2次;滴加5%BSA封闭液，室温20 m in，甩去多余液体，不洗;滴加兔抗鼠Nogo－A一抗(1∶50)，4℃过夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗2 m in×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20 m in。PBS (pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加试剂SABC，37℃20 m in，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 m in×4次; DAB显色:使用DAB显色试剂盒，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，脱水，透明，封片，显微镜观察。免疫组织化学染色阴性对照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗，其余步骤同上，以检查Nogo－A免疫反应的特异性。

1.7 图像分析

切片在统一放大倍数下，在大脑梗死区周围随机选10个视野，运用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析，记录平均阳性细胞数。

1.8 统计学方法

所得数据经正态分布及方差齐性检验后进行单因素方差分析，数据用SAS8.1版统计软件进行分析，所用计量资料均采用±s(均数±标准差)表示。

2 结果

各组大鼠MCAO术后Nogo－A蛋白表达的变化，见表1。

表1 不同时间点各组大鼠Nogo－A表达(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

表1 不同时间点各组大鼠Nogo－A表达(±s)Tab.1 Expression of Nogo－A in all experimental groups at different stages

注:与同时间点正常对照组比较:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001。与同时间点的模型组比较，☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001。Note:Compared with the normal control group at the same stage:☆☆t=－9.95，P＜0.0001;△△t=－17.02，P＜0.0001;▲▲t=－20.74，P＜0.0001;▽▽t=－12.25，P＜0.0001;▼▼t=－9.48，P＜0.0001.Compared with the model group at the same stage:☆t=－1.63，P=0.1210＞0.05;△t=6.23，P＜0.0001;▲t=9.74，P＜0.0001;▽t=8.52，P＜0.0001;▼t=9.05，P＜0.0001.

时间点stage正常对照组Normal control假手术组Sham operation模型组Model药物组Medicine 3 days 9.54±1.49 9.75±1.88 18.15±2.47☆☆20.00±2.57☆1 week 8.56±1.34 8.32±1.26 24.69±2.98△△17.63±1.33△2 weeks 8.76±1.37 8.90±2.25 30.33±3.26▲▲19.31±1.91▲4 weeks 9.50±3.43 9.57±2.20 27.32±3.09▽▽14.86±3.03▽6 weeks 10.10±2.18 8.96±2.66 20.69±3.05▼▼10.67±1.96▼

Nogo－A免疫阳性产物呈棕黄色，在胞质中表达。研究结果表明，正常对照组和假手术组大鼠脑组织中的抑制因子Nogo－A处于较低的表达状态，且在各时间点没有明显的变化，且二者之间差异无显著性(P＞0.05)。模型组大鼠脑内的Nogo－A在梗死后即开始表达，逐渐增高，于2周时达到高峰，然后逐渐降低，至第6周时还处于高表达状态，明显高于正常对照组，且各时间点Nogo－A的表达与正常对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。说明神Nogo－A在脑梗死后较快的表达，在恢复期达到高峰，并在后遗症期还处于高表达状态，可见在脑梗死后各期Nogo－A均参与神经再生抑制。药物组大鼠梗死后脑内的Nogo－A表达增高，其中，3d药物组中Nogo－A的表达与模型组比较差异无显著性(P＞0.05)，其余各药物组中Nogo－A表达与模型组比较差异均有非常显著性(P＜0.01)，说明复健片能有效解除神经再生抑制。

3 讨论

早在1928年，Cajal就认为中枢神经系统再生失败的主要原因不是发出神经纤维的神经元的缺陷，而是缺乏适合的微环境［5］。大量研究认为神经生长抑制因子的存在是中枢神经系统难以有效再生可能的原因，怎样弃除或减轻抑制因素对神经轴突再生的抑制作用是目前研究的重点。目前相继发现了数个具有抑制轴突再生的因子，美国加州大学Goldberg等［6］认为Nogo基因的发现是“探索脊髓损伤和卒中病人治疗漫长道路中的一个里程碑”，其中Nogo－A具有最强的抑制神经生长的作用，并通过多位点的相互作用激活NgR启动神经细胞内的信号转导通路，抑制轴突再生和结构的重塑性［7］。Nogo－A是CNS髓鞘磷脂神经元轴突生长抑制因子，是一个主要在少突胶质细胞的胞体和突起表达的膜蛋白，其两个结构域在抑制轴突生长方面发挥着协同作用［8］，在CNS中提供限制神经纤维延长的生长环境，它在体内和体外都显示出了抑制神经轴突生长的作用［9，10］。在脑损伤后，Nogo－A可以抑制轴突再生［11］，而拮抗Nogo－A后所获得的再生神经纤维是有功能性的，并能形成有功能的突触联系［12］。因此，Nogo－A在具有高度可塑性的大脑区域的神经元回路塑型过程中具有显著的抑制作用，如不能有效解除抑制效应，中枢神经再生难以达到有效的康复水平。

近年来的研究证实，中药可以诱导中枢神经系统产生有利的微环境促进神经再生，但这些研究均是从促进神经生长正性调节因子表达的角度来探讨中药的作用机制，而对能否下调抑制因素的表达，促进缺血后重塑，鲜有报道。

中医认为，脑梗死的主要病机是机体在各种病理因素作用下，机体阴阳失调，肝肾阴精受损，风火痰气血等病理产物旋而变生，在各种诱因作用下引发而致。其病机关键为肝肾阴虚，肝肾阴虚成于中风之先，是脑梗死发病的根本，已病之后贯穿于脑梗死的整个病理过程，且在其发展演变和治疗过程中往往进一步伤耗阴津。故宜采用滋补肝肾法治疗脑梗死，复健片正是根据此法而设，由何首乌、淫羊藿、海马等组成，具有调补肝肾之效，补肾以填精生髓，补肝以养春生之木气，助肾生髓，肝肾并补，意在加强生髓以充脑。复健片是王新陆教授的经验方，由制何首乌、桑寄生、草决明、海马、淫羊藿等五味药组成。何首乌为君药，能滋补肝肾，养血益精。桑寄生为补肾补血要剂，且偏走于肢体筋脉;草决明，既有滋阴补肝肾之功，又有清肝热熄肝风之效，二味同有滋补肝肾之功，共扶何首乌固本培源，是为臣药。海马能补元阳、调和气血，淫羊藿有补命门肝肾，能壮阳益精之效，二味皆为性温之品，温则行，一防滋腻;二可激发肾气，和调阴阳;三有通行气血之用，故稍佐此二味。诸药合用，共奏滋补肝肾，益精补髓之功。

研究结果表明，Nogo－A免疫阳性产物呈棕黄色，在胞质中表达。正常对照组和假手术组大鼠脑组织中的抑制因子Nogo－A一致处于较低的表达状态。梗死后大鼠脑梗死区周围的Nogo－A即开始表达，并逐渐增高，于2周时达到高峰，然后逐渐降低，至第6周时还处于高表达状态，明显高于正常对照组，与正常对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。说明Nogo－A始终参与中枢神经再生。复健片干预的药物组在3 d时与模型组之间Nogo－A表达差异无显著性，其余各时间点药物组与模型组比较差异均有非常显著性(P＜0.01)，说明复健片不能在短时间内显著抑制Nogo－A表达，可能是由于中药起效缓慢所致。1周后复健片组大鼠脑梗死区周围的Nogo－A表达受到显著抑制。研究结果表明复健片可通过抑制神经生长负性调控因子的表达，解除中枢神经再生的抑制，从而发挥促进脑梗死后的神经发生的作用，这也可能是中药促进脑梗死患者临床康复的机制之一。

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［12］Wang KC，Koprivica V，Kim JA，et al.Oligodendrocyte－myelin glycoprotein is a Nogo receptor ligand that inhibits neurite outgrowth［J］.Nature，2002，417(6892):941－944.

Effect of a Traditional Chinese M edicine，“Fujian Tablet”，on Nogo-A Exp ression in Brain Tissue of Rats w ith Cerebral In farction at Different Stages

HU Huai－qiang1，ZHOU Yong－hong2，MA Xue－sheng3，WANG Xin－lu3
(1.Department of Neurology，Jinan M ilitary Region General Hospital，Jinan 250031，China;2.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071; 3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355)

ObjectiveTo observe the effect of a traditional Chinese nedicine，“Fujian tablet”，on the expression of Nogo－A in brain tissue of rats with cerebral infarction at the different stages，and to explore its mechanism on neural regeneration.M ethods Two hundred and forty healthy male Sprague－Dawley rats were random ly divided into 4 groups: normal control，sham operation，model and medicine groups，which were random ly divided into five subsets(n=12)at 3 d，1 w，2 w，4 w and 6 w stages after cerebral infarction，respectively.The rat models with middle cerebral artery occlusion were successfully established by an improved Longa EZ procedure.Fujian tablet was dissolved in water and given to the rats of treatment groups by gastric gavage，while the other groups received distilled water.The expression of Nogo－A in the brain tissue around the infarction was detected by immunohistochem istry.ResultsNogo－A expression was observed at a short period after cerebral infarction in the model group，and increased gradually，reached a peak at 2 weeks and was still positive at 6 weeks after infarction.The differences between model and normal control groups were significant at the same stage(P＜0.01).The difference between medicine group and model group was not significant(P＞0.05)at 3 days，but significant(P＜0.01)at other stages.ConlusionThe Fujian tablet can promote neurogenesis by inhibiting theexpression of Nogo－A.

Fujian tablet;Cerebral infarction;Neural regeneration;Inhibiting factor;Nogo－A

R－255

A

1005－4847(2010)02－0118－04

2009－08－10

国家自然科学基金(编号:30672745);山东省科学技术发展计划(编号:2006GG3202005)

胡怀强(1978－)，男，山东临沂人，临床医学博士，博士后，主要从事中西医结合治疗神经系统疾病的基础与临床研究。E－mail:huhuaiqiang@126.com，TEL:013156189722