穴位埋药线与穴位注射对脑缺血大鼠皮质区MMP－9影响及比较观察＊

孔立红 周红娟 叶煜婉 杜艳军 崔常香 周 华

穴位埋药线与穴位注射对脑缺血大鼠皮质区MMP－9影响及比较观察＊

孔立红 周红娟 叶煜婉 杜艳军 崔常香 周 华

目的观察局灶性脑缺血再灌注大鼠脑皮质区组织基质金属蛋白酶－9(MMP－9)的表达及川芎嗪缓释剂穴位埋药线和川芎嗪穴位注射干预对其的影响。方法将SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组(1d组、3d组、5d组)、穴位注射组(1d组、3d组、5d组)、穴位埋药线组(1d组、3d组、5d组)、尾静脉注射组(1d组、3d组、5d组)。采用改良线栓法制备局灶性脑缺血(MCAO)再灌模型。穴位埋药线组在大椎、百会穴埋入胶原川芎嗪缓释剂药线;穴位注射组在大椎、百会穴注射川芎嗪注射液;运用蛋白免疫印迹法检测缺血侧脑皮质区组织MMP－9蛋白的表达和含量。结果穴位埋药线组与穴位注射组能明显下调缺血侧脑皮质中MMP－9的表达和含量，与模型组比较差异有统计学意义，其中穴位埋药线组的下调作用最明显，与穴位注射组相比较差异有统计学意义。结论穴位埋药线可下调脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮质组织MMP－9的表达，进而可能减少脑微血管基底膜的降解，保护微血管的完整性，减少脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注 穴位埋药线 百会 大椎 基质金属蛋白酶－9

湖北中医药大学(武汉430061)

＊国家中医药管理局基金资助项目(No.06－07JP27)

脑微血管通透性的改变是脑缺血再灌注损伤发生的重要原因之一，其通透性的改变与微血管内皮细胞紧密连接和微血管基底膜及细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)密切相关，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在这一过程中起着主要作用。已有研究表明[1]，脑缺血时MMPs表达增加，可降解血管基底膜，破坏脑微血管的完整性，加重脑缺血再灌注损伤。因此，笔者采用胶原川芎嗪制备缓释剂(药线)，植入大椎、百会穴，观察脑缺血再灌注大鼠皮质区组织MMP－9的含量变化，并与穴位注射和静脉注射相比较。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，共72只，雌雄不限，体质量(200±20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物编号:医动字第19－069号。于实验前1周购进，饲养于安静、温暖且避强光的环境中，室温(22±2)℃，自由饮水饮食。

1.2 试药及仪器 采用酸溶解法从大鼠鼠尾肌腱提取胶原蛋白[2]，和川芎嗪注射液 (北京市永康药业有限公司，规格2mL:40mg)按照一定比例制成药线，长约2m，药物含量为0.2mg，常温干燥，紫外照射消毒，备用。Western blotting检测试剂(中杉金桥生物有限公司);10%水合氯醛、生理盐水、多聚甲醛购于武汉化学试剂公司。电热烧灼器(上海医疗器械厂);无菌医用缝合尼龙线(上海医用缝合针厂);TS400D型电子天平(Ohaus，USA);MiliQ纯水净化仪(MiliQ，USA)。

1.3 模型制备 选择直径为0.25～0.28mm单股缝合尼龙线，长50mm，将插入端加热熔化，使之成为光滑球面，直径约0.30mm，用酒精清洁后置于生理盐水中备用。局灶性脑缺血(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌模型的建立采用改良线栓法[3]。大鼠造模前禁食不禁水24h，称重后以10%水合氯醛(0.3mL/100g)进行腹腔麻醉并保温。麻醉大鼠仰卧固定于手术台上，常规皮肤消毒后，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)，分离出颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)。电凝ECA入脑分支，结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)，并在其起始部位置一动脉夹。先将CCA用动脉夹夹住，再在ECA残端剪0.2mm的小口，将线栓插入。轻推尼龙线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，至大脑中动脉(MCA)，遇阻即止。尼龙线插入深度约18mm，30min后，抽取线栓对大鼠进行脑缺血再灌注，缝合切口后，用碘酒消毒。动物保温喂养，注意观察造模大鼠生理指征。

1.4 模型筛选 采用Zea－longa[4]评分方法，当造模大鼠清醒后，即评定动物神经功能缺损。0分:正常;1分:对侧肢体屈曲;2分:拖住尾巴后拉时，对侧肢体无力;3分:拖住尾巴后拉时，向对侧转圈;4分:自发向对侧转圈或倾倒;5分:无任何自发活动。神经功能障碍在1分以上的大鼠视为成功模型。

1.5 分组及给药 将造模成功的大鼠分为模型组、穴位埋药线组、穴位注射组及尾静脉注射。每组再按时相分为1、3、5d 3个亚组，每个亚组6只大鼠。

穴位埋药线组[5]:28号1.5寸针灸针剪去针尖、磨平，穿入7号注射针头制成埋药工具。大鼠的百会、大椎穴常规备皮、消毒，药物经紫外线照射消毒，埋药针具经常规高温消毒。将药线装入注射针头，百会、大椎穴埋药时，直刺3mm，轻推针灸针针柄埋入药线，然后缓慢退出注射针头，埋药处常规消毒。脑缺血再灌注后1h穴位埋药1次，以后每天埋药1次，取材当天不埋药治疗。穴位注射组:注射穴位常规备皮、消毒，用5号注射针头垂直刺入大椎2mm、向前斜刺入百会2mm，回抽无回血后，缓慢推入川芎嗪注射液，剂量为0.1mL/100g，10s推注完毕。在脑缺血再灌注后1h注射1次，以后每日注射1次，取材当天不注射治疗。尾静脉注射组[6]:鼠尾酒精消毒，充分显露尾静脉，用5号注射针头缓慢推注川芎嗪注射液，剂量为33mg/kg。脑缺血再灌注后1h尾静脉注射1次，以后每天注射1次，取材当天不注射治疗。

1.6 标本采集及检测 取各组大鼠以10%水合氯醛麻醉，迅速断头取脑，在冰盘上迅速剥离皮质，切取视交叉前后3mm的部位，放入液氮罐 (－196℃)中速冻后，移至－80℃冰箱中保存。蛋白免疫印迹法[7]测定大鼠脑缺血侧皮质区组织MMP－9蛋白的含量，具体方法严格按照说明书上进行操作。运用Gel Document Analysis System中Gel base/Gel plot分析软件对目标带进行分析，测出条带的光密度值，各组MMP－9的含量用其占正常值的百分比表示。

2 结果

见图1、表1。假手术组大鼠皮质组织MMP－9含量与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05);模型组大鼠缺血侧脑皮质区可见明显MMP－9表达，模型1d组表达明显升高，3d组到达高峰，5d组有所降低，与其他3组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。穴位埋药线组能明显下调MMP－9的表达，与穴位注射组和尾静脉注射组相比较均有明显差异(P＜0.01)。

图1 各组大鼠皮质MMP－9蛋白的表达(92kD)

表1 各组大鼠皮质组织MMP－9的光密度值(%，±s)

表1 各组大鼠皮质组织MMP－9的光密度值(%，±s)

注:与假手术组比较，■P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与穴位埋药线组比较，＊P ＜ 0.01

1d 5d分 组正常组假手术组模型组穴位注射组尾静脉注射组穴位埋药线组n 6 18 18 18 18 18 0.0131 ± 0.0003 0.0584 ± 0.0036■0.0350 ± 0.0020△＊0.0308 ± 0.0022△0.0249 ± 0.0003△＊3d 0.0131 ± 0.0006 0.0131 ± 0.0008 0.0601 ± 0.0009■0.0383 ± 0.0025△0.0460 ± 0.0085△＊0.0303 ± 0.0009△＊0.0131 ± 0.0009 0.0579 ± 0.0029■0.0347 ± 0.0026△0.0446 ± 0.0022△＊0.0227 ± 0.0006△＊

3 讨论

局灶性脑缺血可以引起基底膜结构的变化，导致微血管出血，脑微血管通透性的改变，从而加重脑缺血再灌注损伤。而基底膜主要由ECM分子构成，能维持血管的结构完整。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌－依赖内生肽酶[8]，为ECM蛋白水解酶，可降解基底膜的ECM成分，增加血管通透性，促使内皮细胞增生、移行，破坏血管的结构完整，影响新生血管的形成，在脑缺血再灌注损伤的进展和恢复过程中发挥至关重要的作用[9－10]。

MMP－9是一种分子量为92kD的糖蛋白，由中性粒细胞、单核细胞、胶质细胞、血管内皮细胞等分泌[11]，能够清除ECM，促进反应细胞生长、移行。MMP－9的降解产物能使纤溶酶原水解生成血管他丁，促进内皮细胞凋亡，破坏毛细血管完整性，抑制血管新生的作用[12]。在局灶性脑缺血后，MMP－9活化，降解基底膜成分，破坏微血管完整性，损伤血脑屏障，并影响随后的血管再生[13]。

研究表明川芎嗪有解痉、降低血管阻力和强烈抑制血小板聚集的作用，对已聚集的血小板有解聚作用，能明显降低全血黏度，治疗缺血性脑血管病效果良好[14]。川芎嗪和胶原制成的缓释剂具有长效作用和恒释作用[15]。本实验用胶原川芎嗪药线，选取督脉的大椎、百会穴位进行埋药线。结果 表明，模型组各时相大鼠MMP－9含量较正常大鼠及各治疗组大鼠显著升高，提示MMP－9确实参与了脑缺血再灌注后病理损伤过程，与文献报道一致[16]。穴位埋药线组大鼠缺血侧脑皮质组织中MMP－9的含量明显低于穴位注射组和尾静脉注射组，并随时间推移趋于正常水平。穴位埋药线可能通过降低脑缺血再灌注后MMP－9的表达，抑制微血管细胞外基质的降解，保护血管结构的完整性，减少脑缺血再灌注损伤，从而起到脑保护作用。其作用优于其他治疗方法，推测穴位埋入胶原川芎嗪缓释药线可能发挥了药物、穴位双重作用。这与我们前期实验结果相符[17－19]。

针刺是临床常用的治疗脑血管疾病的有效方法之一，缓释剂是近年研究发展的一种新剂型，具有长效作用和恒释作用。胶原中药缓释剂在穴位埋药线，是一种新的剂型和特殊的治疗方法，具有一定的治疗优势及特点。

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Effects of Embedding Medicine in Acupoints and Point Injection on Matrix Metalloproteinase-9 of Cortex Tissues in Rats with Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

KONG Li-hong，ZHOU Hong-juan，YE Yu-wan，et al
Hubei University of Chinese Medicine(Wuhan 430061)

Objective:To observe the MMP－9 expression and concerntration in cortex area of rats with cerebral ischemia.And to discuss the effect of embedding medicine in acupoint and point injection with tetramethylpyrazine in this diseaseMethods72 SD rats were randomly divided into the normal group，the sham operation group，the model groups(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)，the acupoint injection group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)，the embedding medicine in acupoints group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)and the tail vein injection group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group).The model of cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion was developed by occluding rat’s right middle cerebral artery following suture occlusion method.After establishing the model successfully，the embedding medicine in acupoints group was implanted into Baihui(GV 20)and Dazhui(GV 14).The injecting medicine in acupoints group was injected into Baihui(GV 20)and Dazhui(GV 14).The content of MMP－9 in cortex tissues was evaluated with western blotting.ResultsThe content and the expression of MMP－9 in cortex tissues of model groups was significantly higher than that of other three groups.The content of MMP－9 in the cortex tissues of the groups of embedding medicine in acupoints，comparing with the groups of injecting medicine into rats’tail veins and of injecting medicine in acupoints， was cut down signifficantly.Comparing the groups of injecting medicine into rats’tail vein and the groups of injecting medicine in acupoints，the expression of MMP－9 of the frontier was less than the laster.ConclusionThe method of embedding medicine in acupoints could inhibit the expression of the MMP－9 in cortex tissues of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury to protect the brain and decrease the reperfusion injury.

Cerebral ischemia reperfusion;Embedding medicine in acupoint;Baihui(GV 20);Dazhui(GV 14);MMP－9

R285.5

A

1004－745X(2010)10－1718－03

2010－01－10)