甲强龙、电针联合 AECs移植治疗脊髓损伤的实验研究

李一帆, 陈 东, 苏 略, 薛 辉, 刘佳梅

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是人类致残率最高的疾患之一,尤其是由于损伤常导致损伤平面以下运动和感觉功能的丧失,给家庭和社会带来巨大经济负担。近年来的研究表明,羊膜上皮细胞可分泌多种神经营养因子,能促进神经元的存活及其轴突生长,在脊髓损伤的治疗方面起着重要作用,使其逐步成为移植治疗神经损伤较好的细胞来源。本实验探讨了甲强龙、电针与 AECs联合治疗对脊髓损伤后运动功能的恢复情况,为临床脊髓损伤的综合治疗提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 大鼠 AECs的分离和培养 取妊娠中期(12～14d)Wistar大鼠,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,在无菌条件下剥下胎膜内层的羊膜,收集AECs,加入含10%灭活的胎牛血清的 DMEM/F12培养液,以细胞数为 1×109个/L的密度接种到培养瓶中,置 37℃、5%CO2的细胞培养箱中静置培养。

1.2 实验动物及分组 60只体重 200～250g雌性健康的 Wistar大鼠,由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。随机分为 5组,每组 12只。A组(SCI损伤对照):做 SCI手术,不进行治疗;B组(甲强龙-MP治疗):SCI后,立即静脉推注甲强龙30mg/kg,4h后重复 1次,30mg/kg,此后,静脉推注甲强龙 30mg/kg,2次/d,共 3d;C组(MP+电针):除了甲强龙治疗外,SCI后 4h,行华佗夹脊穴电针治疗。损伤平面上、下各 2对取穴,左、右穴位交替使用,选用长 25mm、直径 0.35mm的毫针,上海产6805-II型治疗仪,正 、负极 ,疏密波 ,频率 1 ～2Hz,强度 0.3～1.0 mA,以针刺处肌肉轻微抖动为宜,持续15min,此后 1次/d,6d为 1疗程,间隔 2d,进入下一个疗程,共治疗 3个疗程;D组 (MP+电针 +AECs):在进行甲强龙和华佗夹脊穴电针治疗的基础上,SCI后第 7天,用微量注射器在脊髓损伤处移植 AECs 5μl,浓度 :1×107个 /μl;E组(假手术 ):只打开椎板,暴露脊髓,不造成 SCI。

1.3 模型制作及术后护理 所有器械经高压蒸汽灭菌。用 10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g),用咬骨钳和骨剪以开骨窗的方法去除 T10椎板,用自制改良的 Allen's撞击器,以 60g·cm致伤力损伤大鼠 T10胸椎对应的脊髓(SCI)。术后开始每日腹腔注射青霉素 8万 U/只,庆大霉素 0.2万U/只,维持 7d。定时定量给以软饲料喂养,饮水不加限制,人工排尿,直到自身排尿反射恢复。各组大鼠均饲养 30d后取材。大鼠共计死亡 2只,出现在A组术后 20d,解剖后发现死因为肠梗阻,随后补充2只入实验。

1.4 检测指标

1.4.1 免疫荧光组织化学观察 每组取 6只大鼠,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,生理盐水、4%多聚甲醛常规灌流固定,暴露脊髓 T8～T12,迅速取出脊髓组织,4%多聚甲醛后固定 4h,梯度蔗糖脱水,OCT包埋,-70℃保存。用恒冷箱切片机做冠状面切片,厚 16μm,切片经 10%羊血清封闭30min,5-HT一抗(兔抗大鼠,美国 Sigma公司 1∶100稀释)4℃过夜,PBS冲洗;二抗(FITC标记羊抗兔,美国 Jackson Immunoresearch Labs 1∶200稀释),室温 1h,PBS冲洗,甘油明胶封片。每只动物随机取 3张切片,于 200倍镜下选择脊髓损伤区中部的视野,显微照片输入计算机,用 Imagepro-plus(IPP)图像分析软件计数每张切片 5-HT阳性神经纤维的密度。

1.4.2 行为学观察 参照 Basso等提出并改良的脊髓损伤大鼠功能恢复评判标准即 BBB评分法[1,2](共 21级),双盲法对各组动物后肢运动能力进行评估,每隔 3d定时记录大鼠双后肢运动功能恢复情况。

1.4.3 神经电生理检测 术后 30d,每组取剩余 6只大鼠,做运动诱发电位(MEP)检测。将受检大鼠用 10%水合氯醛作腹腔麻醉,在头颅后部,消毒皮肤,切开头颅后部皮肤,剥离骨膜,用牙科钻在右侧皮层中央后回感觉区相对应的冠状缝后 3mm,矢状缝旁 1mm处钻一盲孔;左腿部剪毛,并暴露左腿坐骨神经。用 Powerlab诱发电位仪,BL-410生物机能实验系统,刺激参数:粗电压,强度 3V,波宽1ms,频率 10 Hz,增益 20倍,滤波 300Hz,时间常数0.01s,扫描速度 6.25ms/div。刺激电极置于皮层,记录电极位于坐骨神经,参考电极位于硬腭下。所有大鼠检测完后测量其潜伏期和峰-峰值,进行统计学分析。

1.5 统计学分析 测量的各项数据用 SPSS 10.0统计软件包进行方差分析,统计结果以均数 ±标准差±s)表示,检验标准 P＜0.01。

2 结 果

2.1 免疫荧光组织化学所见 在本实验中,A组损伤区域内未见 5-HT阳性的运动神经纤维,B组偶见少量的呈绿色荧光的 5-HT阳性神经纤维,C组损伤区内可见少量、短小且无序的 5-HT阳性神经纤维,D组可见大量的 5-HT阳性的神经纤维通过损伤区,长度较 C组明显增加,直径粗细不等,且纤维走行方向较一致,几乎平行排列,绿色荧光着色增强,E组 5-HT阳性的神经纤维繁多,较长,分布均匀,平行排列,规则有序。D组与 E组最为接近,与其它各组相比 5-HT阳性的神经纤维密度及长度,差异显著(见表1、图1)。

2.2 行为学变化 手术前所有实验动物双后肢 BBB评分均为 21分。A组大鼠脊髓受撞击损伤后都出现双后肢瘫痪,术后 1w内未见功能恢复,2w开始恢复,但恢复缓慢,到第 3周基本停止,只能恢复到后肢 3个关节的广泛活动而不能持重行走。B组、C组和 D组在 SCI后经过治疗,都有不同程度的后肢功能恢复,其中以 D组恢复最为明显,最接近 E组。E组术后第 1天,后肢出现短暂性活动迟缓,第2天明显恢复,1w后功能恢复接近正常。A组与其它各组比较均有明显差异(见表2)。

2.3 神经电生理检测结果 A组已经失去正常波形,经过不同治疗的 B、C、D组与 A组相比较,MEP的峰-峰值都有明显的增加,且潜伏期均有不同程度的缩短,其中以 D组效果最好,恢复程度最接近 E组。各组之间相比较,差异显著,P＜0.01(见表3、图2)。

表1 实验各组大鼠脊髓损伤处 5-HT阳性神经纤维计数(n=6,±s/mm2)

表1 实验各组大鼠脊髓损伤处 5-HT阳性神经纤维计数(n=6,±s/mm2)

与 B组比较*P＜0.01;与 C组比较△P＜0.01

A组B组 C组 D组 E组013.28±1.9775.56±19.42*158.39±25.39*△257.72±20.79*△

表2 实验各组后肢运动功能的BBB评分比较(n=12,±s)

表2 实验各组后肢运动功能的BBB评分比较(n=12,±s)

与 B组比较*P＜0.01;与 C组比较△P＜0.01

组别 3d 6d 9d 12d 15d 18d 21d 24d 27d 30d A组 B组 C组 D组 E组00.5±0.10.9±0.2*0.9±0.2*△9.4±0.4*△0.68±0.591.56±0.522.65±0.87*2.7±0.6*△19.6±0.8*△1.85±0.682.48±0.633.12±0.88*3.5±0.5*△20.1±0.8*△2.42±1.033.64±0.874.61±1.21*6.2±1.3*△20.9±0.1*△3.71±1.154.95±1.016.23±1.14*8.2±1.7*△21*△4.69±1.465.23±1.177.05±1.42*9.7±1.3*△21*△5.14±1.275.64±1.157.36±1.35*11.8±1.6*△21*△5.56±1.036.42±1.217.61±1.52*13.3±1.7*△21*△5.56±1.036.83±1.267.80±1.34*14.6±1.2*△21*△5.56±1.037.00±0.618.20±0.65*15.2±1.0*△21*△

表3 实验各组 MEP-运动诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=6,±s)

表3 实验各组 MEP-运动诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=6,±s)

与 B组比较*P＜0.01;与 C组比较△P＜0.01

A组B组 C组 D组 E组4.73±0.354.25±0.323.61±0.13*2.65±0.21*△2.01±0.02*△5.95±1.0315.40±2.9541.89±0.48*63.70±2.40*△80.76±0.53*△

图 1A～E 实验各组脊髓冠状面,5-HT免疫荧光染色,示 5-HT阳性神经纤维(Bar=50μm)

图2 实验各组 MEP波形

3 讨 论

1990年和 1992年Bracken等有关治疗急性脊髓损伤的研究证实:只有应用大剂量的甲强龙(Methylprednisolone,MP)才能起到有效的神经保护作用 ,MP是一种人工合成的类固醇糖皮质激素,目前已广泛应用于临床脊髓损伤的治疗[3]。针灸作为一种传统的康复治疗手段,在多年的临床应用和实践中取得了较好的疗效[4～6]。针刺可以刺激中枢神经系统中内啡肽、复合胺、P物质、降钙素基因相关肽、神经肽 Y等物质的释放[7]。近年来有关 AECs在神经损伤后再生中的作用研究颇有报道。Davis等[8]发现羊膜基质的非细胞性提取物,在体内、外均能促进睫状神经元轴突的再生,对在体成年大鼠海马区的胆碱能神经元具有营养作用。Uchida等[9]利用人AECs条件培养基,体外培养 E18d大鼠神经元细胞系,研究显示,培养基的神经营养作用来源于人AECs合成释放的 BDNF、NT-3和 NGF,提示羊膜组织通过 AECs分泌释放的 NTFs在胚胎神经发育的早期阶段具有重要调节作用。孟晓婷等人的研究还表明大鼠 AECs也表达神经干细胞特征性抗原 Nestin以及 Musashi[10],提示 AECs与神经组织细胞具有一定的同源性与相似性,能够很好的与神经组织整合,且 AECs具有低免疫原性,取材方便,不涉及伦理法律问题等,这些均为本实验提供了理论依据。

5-羟色胺能神经纤维主要来源于脑干中缝核群,其下行投射系统主要投射到脊髓前角运动神经元,在前角以经典的突触连接形式为主。下行到脊髓的5-HT阳性神经纤维,与运动信息传递有关。在本研究中D组即甲强龙、电针联合大鼠 AECs移植治疗脊髓损伤处 5-HT阳性的神经纤维数量明显增多,与 E组即假手术组最为接近,且阳性纤维能够长距离生长,并通过损伤区达到脊髓远端,说明实验中采用的联合治疗方法促进了 5-HT阳性神经纤维的再生,其机制推断为 AECs与电针刺激通过直接或间接途径使突触末端的 5-HT递质分泌增加并作用于脊髓前角运动神经元,部分恢复了上位中枢对脊髓远端的调控,表现为 BBB评分提高,在 D组观察到明显的后肢运动功能恢复,可以达到持续爪掌支持行走,持续前后肢协调。1985年 Barker等人[11]发明无痛、非侵入性的经颅磁刺激技术之后,运动诱发电位 MEP广泛用于临床,侧重于对脊髓损伤的诊断及预后评估。MEP是刺激中枢神经组织并在脊髓远端、外周神经或肌肉记录到的电信号,能直接检测脊髓下行传导束的功能状态,同时在治疗中判断疗效及预后特别是评估运动功能的恢复有着重要参考意义[12]。本研究中 D组 MEP峰-峰值和潜伏期虽没有完全恢复到 E组程度,但是与其它治疗组相比有显著差异,具有统计学意义。

以上结果表明,甲强龙、电针与 AECs移植联合治疗脊髓损伤极大的促进了 5-羟色胺能神经纤维的再生,有效的恢复了 SCI大鼠后肢运动功能。本研究采用中西医结合方法,应用我国传统中医针灸理论技术与现代细胞移植新技术相结合治疗脊髓损伤,为脊髓损伤的治疗提供了新的实验依据。

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