狗枣猕猴桃叶提取物黄酮对大鼠急性脑缺血后caspase-3、VEGF表达的影响

贾明月, 陈嘉峰, 杨东娜, 王 靖, 金永日

大量研究已经证实,银杏叶提取物银杏黄酮因其具有清除自由基、抑制脂质过氧化、调整血液循环、保护神经细胞等作用,被广泛应用于缺血性脑血管疾病治疗领域。近年来有研究发现,狗枣猕猴桃叶[Actinidia kolomikta(Rupr.et Maxim)Planch.]亦含有与银杏黄酮相类似的物质[1]。因此,我们开展了对狗枣猕猴桃叶的化学成分以及药效学等研究,从中提取分离了 9种黄酮类化学成分,发现黄酮成分的主要结构与银杏叶提取物银杏黄酮的结构是极其相似的,并且狗枣猕猴桃叶总黄酮的组分远远多于银杏黄酮[2]。基于此研究,我们认为狗枣猕猴桃叶提取物黄酮可能具有治疗缺血性脑血管病的作用,有可能在某些方面与银杏黄酮具有相同的药理作用,我们就此开展了相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 选用健康 Wistar雄性大鼠,鼠龄 6～8w,体重 240～280g由长春市高新开发区实验动物中心提供。随机分为 4组,分别为:A盐水对照组、B小剂量给药组、C中剂量给药组、D大剂量给药组。B、C、D组于术前 30min以及术后 2h两次分别给予狗枣猕猴桃叶提取物黄酮腹腔注射。B组(0.2%浓度 0.5ml/100g体重)、C组(0.4%浓度 0.5ml/100g体重)、D组(0.8%浓度 0.5ml/100g体重),A组则在相同时间给予腹腔注射生理盐水(0.5ml/100g体重)。即 B组 =10mg/kg体重,C组=20mg/kg体重,D组 =40mg/kg体重。

1.2 主要药物与试剂 狗枣猕猴桃叶提取物黄酮,由吉林大学化学学院药物化学研究室提供,淡黄色粉末状。TUNEL凋亡检测试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。Caspase-3免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;抗体用兔抗大鼠 Caspase-3抗体,购于武汉博士德生物工程有限公司;兔抗大鼠 VEGF多克隆抗体,购于美国 Santa cruz公司。

1.3 动物模型制备 采用改良 Nagasawa方法制作线栓 MCAO模型。大鼠 10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉后,取颈正中切口切开皮肤及皮下组织,分离左侧颈总动脉,向上分离颈内、外动脉,在分叉处结扎颈外动脉根部,近心端距离分叉处1.5 cm处结扎颈总动脉,用尼龙线穿过颈内动脉并向外侧拉紧以阻断血流。在颈总动脉距离分叉处0.5cm处剪一小口,插入直径为 0.234mm的断端打磨得较光滑的尼龙线,事先在尼龙线的 1.8cm处用记号笔作标记,待尼龙线通过分叉进入颈内动脉时放松穿过颈内动脉的尼龙线,使尼龙线进一步进入颈内动脉,进入长度约 1.8cm±0.05cm,阻断左侧大脑中动脉血流,造成局灶性脑缺血。假手术组步骤同上,但尼龙线插入深度约为 1.2cm。

2 检测指标及方法

2.1 神经病学评分 参考 Zea longa法对术后苏醒的大鼠进行功能评分:0分:无神经系统损伤体征;1分:不能完全伸展右侧前爪;2分:行走时向右侧转圈;3分:站立不稳,向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。功能评分 2分以上的为模型成功。如实验有死亡的鼠,则取同批次鼠补足,制成模型。

2.2 TUNEL染色制备及观察 术后 24h后麻醉大鼠 打开胸腔,暴露心脏,从左心室生理盐水灌注,用 4%多聚甲醛 250ml灌注固定至四肢及头尾逐渐僵硬。5min内断头取大脑,放入新鲜配制 4%多聚甲醛中固定,从前到后每隔 2mm切 5片,取中间一片,常规乙醇梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。包埋后组织块连续冠状切片,片厚约 7μm,每个鼠脑取 1张切片进行 TUNEL染色、脱水、透明、封片后显微镜下观察。在缺血侧的大脑皮层及海马区各随机采集 5个高倍视野检测 TUNEL阳性神经细胞,取平均值。

2.3 原位杂交法检测 caspase-3的表达 石蜡切片常规脱蜡后严格按照 caspase-3免疫组化试剂盒的说明书进行操作。胞浆被染成棕褐色为阳性细胞。应用 Meta Morph显微图像分析系统测定额顶叶皮质神经细胞胞浆的灰度值,染色越深,其值越小,反应胞浆内蛋白表达量越高,每张切片随机选择5个视野检测灰度值和计数阳性细胞,取其平均值代表每只大鼠的阳性表达程度。

2.4 免疫组化测定 VEGF的表达 上述方法石蜡包埋后组织块连续冠状切片,片厚约 5μm,用SP法进行免疫组化染色,以胞浆棕色颗粒状着色或核膜着色为阳性细胞。在光镜下以高倍镜(20×10)对各组 VEGF反应阳性的细胞计数,计算每张切片中 VEGF阳性细胞表达数目。每张切片随机选取5个非重叠视野,计算其平均值。

3 结 果

3.1 TUNEL染色 A组(盐水对照组)缺血侧大脑半球皮质、海马区、基底节区可见凋亡细胞,缺血中心区呈散在分布,缺血区边缘内侧成簇分布,阳性细胞胞核呈棕黄色,胞质均质浓缩,胞核深染,轮廓清晰,细胞体积小,边集于核周呈新月形或环形,并且可以见到少量大小不等深染成棕黄色的圆形小体,形似凋亡小体。B、C、D组在缺血侧缺血中心区和缺血周围区亦可检测到凋亡细胞,缺血中心区呈散在分布,凋亡细胞形态与 A组相似,但是数量显著少于对照组(P＜0.05)。D组与 B组、C组比较凋亡细胞明显减少,有统计学意义(P＜0.05)(见表1、见图1 ～图4)。

表1 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目±s)

表1 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目±s)

与 A组比较*P＜0.05;与 D组比较△P＜0.05

组别 样本数(n) 剂量(mg/kg) 凋亡细胞数(个)ABCD 666610204020.73±2.2916.13±2.12*△14.30±1.52*△11.33±2.08*

3.2 caspase-3表达 显微镜下观察到对照组和给药各剂量组梗死侧均有 caspase-3阳性表达。主要分布于大脑皮质、海马和纹状体。caspase-3阳性表达分布部位和检测到的凋亡细胞部位相对应。给药组(B、C、D组)与盐水对照组(A组)相比较,局灶性脑缺血后 24h检测灰度值增加,caspase-3 mRNA表达减弱,P＜0.05有统计学意义。D组和 B、C组比较灰度值增加,caspase-3 mRNA表达减弱,P＜0.05有统计学意义。B组和 C组之间没有明显差异 (见表2、见图5～图8)。

表2 Caspase-3蛋白表达的灰度值±s,n=6)

表2 Caspase-3蛋白表达的灰度值±s,n=6)

与 A组比较*P＜0.05;与 B、C组比较△P＜0.05

组别 样本数(n)给药剂量(mg/kg) 灰度值 阳性细胞数(个)ABCD 666610204080.3±6.7140.6±3.5*162.4±6.1*246.2±4.3*△20.87±3.2815.50±3.57*12.40±3.37*7.50±1.73*△

3.3 VEGF的表达 观察到对照组和给药各剂量组均有 VEGF阳性表达,其主要分布于皮质、海马和皮质下结构。阳性着染细胞主要为神经元,神经胶质细胞,表达于核周胞浆和主树突,胞核为阴性表达。在脉络丛的血管内皮细胞为阳性表达,胞浆着染,胞核为阴性。盐水对照组,血管内皮生长因子阳性着染神经元数目增多,且在脉络组织表达增高。药物干预组,在缺血后24h神经元及脉络组织阳性着染数目均高于对照组的表达数目。给药各组与盐水对照组相比,VEGF表达增强,P＜0.05;根据均数大小,D组VEGF表达多于 B、C给药组,P＜0.05(见表3、见图9～图 12)。

表3 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目±s,n=6)

表3 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡数目±s,n=6)

与 A组比较*P＜0.05;与 D组比较△P＜0.05

组别 样本数(n)剂量(mg/kg)VEGF阳性表达数(个)ABCD 666610204020.73±2.2916.13±2.12*△14.30±1.52*△11.33±2.08*

4 讨 论

局灶性脑缺血发生后神经元的死亡包括坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis)两种方式,且两者可以并存[3]。在缺血灶中心区域以坏死为主,而在缺血边缘区则以凋亡为主。细胞凋亡又称程序性死(programomed cell death,PCD),是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程。凋亡是各种凋亡刺激信号始动,受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径等调控的“瀑布式”级联激活过程[4]。细胞发生凋亡还是坏死由多种因素决定,包括损伤程度、Ca2+超载程度、细胞内 ATP水平以及 caspase-3激活程度。caspase家族在凋亡细胞的死亡中扮演了重要角色[5],作为蛋白酶与细胞凋亡密切相关,起最后枢纽作用[6]。本实验结合了分子生物学和形态特征,采用检测灵敏较高的 TUNEL法原位检测细胞凋亡,免疫组化法检测 caspase-3各缺血部位的阳性表达情况。证实了狗枣猕猴桃叶提取物黄酮可以降低大鼠脑缺血后梗死灶半暗区凋亡细胞数目,并可通过抑制caspase-3的表达而抑制凋亡,从而起到保护脑缺血后神经元的作用。

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF),是在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来并命名的蛋白质,是一种具有高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原。VEGF能通过其受体特异性作用于血管内皮细胞,从而促进血管内皮细胞的增殖,增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能[7,8]。其强大的促进新血管形成的作用使其在梗死性血管病的治疗中发挥巨大作用,在临床上具有较好的应用价值。脑血管闭塞以后,缺血区毛细血管增生,新生血管的形成来源于血管内皮细胞的增殖,而内皮细胞的增殖有赖于VEGF的刺激。VEGF对内皮细胞的生长起趋化和刺激作用,在体内可诱导血管生成。我们通过免疫组化的方法观察了大鼠局灶性脑缺血 24h后 VEGF的表达明显增强,进一步证实狗枣猕猴桃叶提取物黄酮可能通过脑缺血后增强 VEGF的表达来实现其神经保护作用。

通过试验证实狗枣猕猴桃叶提取物黄酮可减少缺血后细胞凋亡的发生、发展,可促进 VEGF的表达,对急性缺血性损伤后神经元具有保护作用。由于本实验仅进行了脑缺血后急性期的研究,但能否通过促进 VEGF的表达来增加缺血后的血管内皮细胞增殖、诱导新生血管的生成,有待进一步研究。

图1 盐水对照组在缺血 24h后 TUNEL检测凋亡细胞 40×

图2小剂量组在缺血后 24h后 TUNEL检测凋亡细胞 40×

图3 中剂量组在缺血后 24h TUNEL检测凋亡细胞 40×

图4 大剂量组在缺血后 24h TUNEL检测凋亡细胞 40×

图5 盐水对照组在缺血 24h检测到caspase-3mRNA阳性细胞 40×

图6 小剂量组在缺血 24h检测到 caspase-3mRNA阳性细胞 40×

图7 中剂量组在缺血 24h检测到caspase-3mRNA阳性细胞40×

图8 大剂量组缺血 24h检测到caspase-3mRNA阳性细胞 40×

图9 盐水对照组在缺血 24h检测到VEGF弱阳性表达 200×

图 10 小剂量组在缺血 24h检测到 VEGF阳性表达200×

图 11 盐水对照组在缺血 24h检测到VEGF弱阳性表达200×

图 12 小剂量组在缺血 24h检测到VEGF阳性表达 200×

[1] 金永日,桂明玉,李绪文.狗枣猕猴桃叶化学成分研究[J].高等学校化学学报,2007,(11):2060-2064.

[2] 王 靖,陈嘉峰.狗枣猕猴桃叶提取物黄酮对大鼠局灶性脑缺血损伤组织病理结构的影响[J].中国卒中杂志,2006,12:842-845.

[3] Schindler CK,Shinoda S,Simon RP,et al.Subcellular distribution of bcl-2 family proteins and 14-3-3 with in the hippocampusduring seizure induced neural death in the rat[J].Neurosci Lett,2004,356(3):163-166.

[4] 李玉梅,饶明俐,谭 岩.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 Caspase-3的表达变化及银杏叶制剂的保护作用[J].中风与神经疾病杂志,2006,23(6):336-337.

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[6] Mc Laughlin B,Hartnett KA,Erhardt JA,et al.Caspase-3 activation is essential for neuroprotection in preconditionging[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(2):715-720.

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