脑梗死人群 NOS1基因多态性与脂代谢的相关性

高 鹏, 吴 江, 杜丹华, 李蕴博, 赵节绪, 胡林森

脑梗死是严重威胁人类健康的常见病,多发病,遗传学研究表明脑梗死是一种多基因遗传病,遗传因素是其发病的一个重要因素[1];而高胆固醇血症、吸烟、糖尿病和高血压等是脑梗死的常见危险因素。

研究表明 ApoE基因敲除鼠表现出明显的高胆固醇血症和进行性的内皮功能障碍[2],高胆固醇血症可降低 NOS1基因的表达[3]。Xie[4]等报道在敲除 ApoE基因诱导的高胆固醇血症小鼠,血管内皮NOS1基因表达下调,进而血管内皮损伤。而 NOS1基因的表达上调可显著改善高胆固醇血症引发的动脉粥样硬化症(AS)[5]。

由此可见,NOS1基因与血管内皮功能和高胆固醇血症的发生可能有关。我们前期研究发现NOS1基因多态性与脑梗死的发生有关[6],在此,本研究探讨了脑梗死患者 NOS1基因多态性与脂代谢的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究共纳入 605例无血缘关系的脑梗死患者。样本来自吉林大学第一医院神经内科 2005年 ～2006年的住院患者,男 430例,女175例,平均年龄 60.1±11.7岁。由 2名神经科医生根据详细的神经科检查、头部 CT或头部 MRI,并依据 TOAST分型标准[7]对脑梗死患者做出诊断,除外房颤、肿瘤等栓子来源的脑栓塞性疾病,除外肝肾功能不全,血液系统疾病。所有入组人群均签署知情同意书,并采集全血用于 DNA提取。

1.2 方法 我们选择了 rs9658281(SNP1,MspⅠsite)和 rs2682820(SNP2,HaeⅢ site)2个单核苷酸多态性位点,采用限制性酶切片段多态性的方法对 SNPs基因型进行分析。应用 DNA提取试剂盒(Promega,北京)提取基因组 DNA。应用 Primer 5.0软件设引物,SNP1上游引物:5'-CAACCCTTAGCTTAAATCAG-3',下游引物 5'-GTGCCAGACCTAAGATGC-3';SNP2上游引物 5'-CCGAGGGT-AACTGGACATTG-3',下游引物 5'-CAAGGTAGGTGCTATAATCTC-3',由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系为 25μl,其中双蒸水 18μl,10mmol Tris-HCl(pH 8.3),50mol KCl,1.5mmol MgCl2,4种dNTP各 200μmol,引物各 0.4μl,Taq DNA聚合酶(Promega,北京)1.0U,基因组 DNA 30 ～ 50ng。PCR反应条件:94℃预变性 5min,94℃变性 45s,55℃复性 1min,72℃延伸 1min,35个循环,最后72℃延伸 10min。酶切体系:PCR产物以限制性内切酶(Promega,北京)于 37℃水浴 4～6h酶切,经2%琼脂糖凝胶电泳(90mV)40min,在凝胶成像系统(UVP,美国)下观察结果。

1.3 统计学分析 应用拟和优度检验分析脑梗死患者基因型频率的分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡;UNPHASED遗传学软件[8]Qtphase对近似正态分布的计量资料总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)进行数量性状分析,应用 UNPHASED遗传学软件 cocaphase进行分析,P＜0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 SNP1和 SNP2位点杂合度分析及 Hardy-Weinberg平衡分析 SNP1经 PCR扩增及 MspⅠ酶切后,产生 GG、AG、AA等 3种基因型,基因型分布GG∶AG∶AA为 497∶100∶8,等位基因分布 A∶G为 116∶1094。 SNP2为 A/C二态 SNP,经 PCR扩增及 HaeIII酶切后产生 C/C、A/C及 A/A 3种基因型,基因型分布 CC∶AC∶AA为 230∶273∶102;等位基因分布 C∶A为 733∶477。拟和优度检验表明入组患者的基因型未偏离 H-W平衡(SNP1χ2=1.309,P=0.252;SNP2 χ2=1.846,P=0.174),说明我们选择的样本是随机婚配的群体。

2.2 NOS1基因 SNP1和 SNP2位点的连锁不平衡分析 应用 UNPHASED软件对 SNP1和 SNP2位点进行连锁不平衡分析显示,SNP1和 SNP2不在同一个连锁不平衡区。

2.3 SNP1和 SNP2位点多态性与 TC、TG、HDL-C、LDL-C、BMI的关系 NOS1基因 rs9658281的等位基因频率与 TC明显相关,携带 G等位基因个体的总胆固醇水平(TC)明显高于携带 A等位基因的个体(χ2=4.583,P=0.032),而与 TG、HDL-C、LDL-C水平无明显相关 (见表1);NOS1基因rs2682820的等位基因频率与 TC与 TG、HDL-C、LDL-C水平无明显相关(见表2)。

表1 SNP1位点多态性与血脂的数量性状分析

表2 SNP2位点多态性与血脂的数量性状分析

3 讨 论

本研究应用数量性状分析方法探讨了脑梗死患者 NOS1基因多态性与血脂水平的相关性。脑梗死是多基因遗传病,它的形成是由于多个微效基因变异的共同作用引起的,这些变异在群体中的分布是连续的,在不同个体间只有量的差异,而无质的不同,常称这类性状为数量性状。因此对多基因遗传疾病的某些连续性性状进行数量性状分析更符合疾病发生的本质。

NOS1基因定位于染色体的 12q24.2-q 24.31[9],全长 ＞240kb,包含 29个外显子,编码nNOS。最近的研究发现,在进化上古老的常见多态中即使是最轻微的有害变异也不会在人群进化中保存下来[10],许多与疾病相关的遗传标记位于非编码区或基因功能未知的区域[11～16]。因此我们选择NOS1基因内含子上的 rs9658281和 rs2682820位点为遗传标记。内含子是基因组中的一种重要调控元件,内含子可通过自身的剪接影响基因的表达,也可直接对基因的表达起调控作用[17],通过对内含子基因多态性的研究可能对疾病的发生提供线索。NOS1基因 5'-非编码区存在选择性剪切位点,不同的 mRNA剪切变体导致 NOS1基因在抑制动脉粥样硬化(AS)新内膜形成及血管保护中作用的差异。我们在脑梗死患者的血浆总胆固醇水平与 SNP1位点的数量性状分析中发现,携带 G等位基因个体的总胆固醇水平明显高于携带 A等位基因的个体(χ2=4.583,P=0.032),证明 G等位基因与血浆增高的总胆固醇水平相关。因此我们推测携带 G等位基因人群的 mRNA剪切变体对高胆固醇血症所致血管内皮损伤的保护作用较弱,从而更易引起 AS的发生,导致脑梗死。

此外,我们的研究人群来自于北方汉族人,这一研究结果还需要在不同地域、不同种族的人群中进行大样本的重复来验证。

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