FSHR基因多态性与不孕妇女卵巢反应的关系

何 峻,周从容,周 桦

(1.贵州省人民医院妇科生殖中心;2.贵阳医学院附属医院生殖中心,贵阳550004)

自从1975年卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)被应用于不孕妇女的超促排卵(controlled ovarian stimulation,COS)治疗以来,FSH一直是体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)治疗时COS的首选药物,适量的FSH是获得多个成熟卵泡并最终实现胚胎移植成功的基础。如何预测卵巢的反应性,以正确使用FSH的剂量是人们一直非常关注的问题。临床常用的检测方法有很多,如年龄、基础FSH水平、窦卵泡数等,都不能很好地预测患者对FSH刺激的反应性。由于FSH在卵子成熟过程中的重要作用,FSH受体(FSH receptor,FSHR)作为FSH在体内发挥作用的最主要的途径,已经越来越受到关注。理论上FSHR基因的多态性可引起FSHR空间结构发生变化,从而影响FSHR与其配体相互作用的过程,引起相关受体信息传递的变化,影响卵巢对FSH刺激的反应,所以有学者认为FSHR基因多态性可能与卵巢对FSH的反应性有关[1]。

目前大家对FSHR基因外显子10上680位的单苷酸多态性(SNP)非常关注,但大家的看法并不一致[2-4]。目前国内外没有全面的对不同人种的多态性分布进行比较的报道。因此,本文拟探讨FSHR基因外显子10上680位的SNP与卵巢反应的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2007年4月至2010年1月在贵阳医学院生殖医学中心就诊的不孕患者120例,均使用常规注射用醋酸曲普瑞林(达菲林,博福-益普生(天津)制药有限公司生产)长方案降调及注射用重组人促卵泡素(果纳芬,瑞士默克雪兰诺公司生产)进行COS治疗。入选标准:①不孕原因为输卵管及(或)男方因素、不明原因者,均无内分泌疾病史或卵巢手术史;②基础性激素FSH＜10 U·L-1;③年龄≤35岁,就诊前3个月无促排卵及类固醇激素使用史;④B超检查无多囊卵巢征象者;⑤既往月经周期规律,经量正常者。

卵巢反应分级根据《现代辅助生育技术》中的分级方法[5],将患者分为3组:获卵数 ≤4个者,为卵巢低反应组(17例);获卵数≥5个且≤14个者分为卵巢正常反应组(83例);获卵数≥15个者为卵巢高反应组(20例)。

1.2 主要试剂及仪器

血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司],PCR体系试剂[宝生物工程(大连)有限公司],引物(上海捷瑞生物工程有限公司),琼脂糖(西班牙Oxoid Ltd公司),超净工作台(苏州净化设备有限公司),Millipore超纯水仪(美国Millipore公司),DYY2C电泳仪、DYY-III5电泳槽(北京六一仪器厂),UVP8000型凝胶成像分析系统(美国Millipore公司),梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)。

1.3 实验方法

实验操作均严格按照《现代分子生物学实验技术》[6]进行,试剂和仪器的使用参照其说明书进行。参照试剂盒说明书提取DNA,用核酸定量仪测定A260和A280,计算DNA浓度和纯度。将DNA纯度在 1.8～2.0 μ g·mL-1的标本的浓度稀释到50 ng·μ L-1,-20 ℃保存,待用。

1.3.1 PCR引物设计及反应体系

参照Falconer H.等[7]采用的引物设计方案,扩增片段长度为 229 bp。上游:5′GCAAGTGTGGCTGCTATGAA 3′,下游 5′GTGACATACCCTTCAAAGGC 3′。

1.3.2 PCR反应体系及循环条件

反应体系为:10×PCR Buffer 2.5 μ L、MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μ L 、dNT P(各 2.5 mol· L-1)2.0 μ L 、5′Primer(10 μ mol· L-1)0.5 μ L 、3′Primer(10 μ mol · L-1)0.5 μ L 、Taq DNA polymerase(3 U · μ L-1)0.2 μ L 、模板 DNA(100 ng · μ L-1)2.0 μ L 、ddH2O 15.8 μ L,总量 25 μ L 。

PCR反应循环条件:94℃预变性5 min;94℃变性 1 min、55℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,循环30次;终末延伸72℃7 min;然后放于4℃冰箱保温待用。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳及测序

PCR产物(与 loading buffer dye 混合成 6 μ L体系)用1.5%琼脂糖凝胶在 150 V电压下电泳30 min,电泳缓冲液为0.5×TBE,用UVP8000型凝胶成像分析系统成像,将具有单一明亮条带的PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司纯化并测序。用BLAST对测序结果进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。

1.4 统计学方法

所有资料采用SPSS10.0软件进行t检验、秩和检验及χ2检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

1) 各卵巢反应组间基本情况的比较见表1。各卵巢反应组间常用监测指标的比较见表2。

2) FSHR的SNP及各SNP在不同卵巢反应组中所占比例:用引物扩增提取的 DNA后得到PCR产物见图1,所得长度为229 bp的PCR产物在测序后经比对证实其确为人类FSH R DNA。测序结果显示120例不孕妇女中FSHR基因外显子10上编码氨基酸的680位SNP,有3种基因型,分别为:Asn680Asn(A/A)、Asn680Ser(A/S)和Ser680Ser(S/S)。SNP的3种测序结果见封四图2,3种SNP所占比例分别为A/A型占60%、A/S型占17.5%和S/S型占22.5%。

表1 各卵巢反应组间基本情况比较 x±s

表2 各卵巢反应组临床常用监测指标比较 x±s

图1 FSHR目的基因片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

3) 3种SNP组间基本情况的比较见表3。

4) 3种基因型组间常用监测指标的比较见表4。

5) 不同卵巢反应组与不同SNP的构成比:卵巢低反应组中以S/S型为主,占58.82%;卵巢正常反应组和卵巢高反应组中均以A/A型为主,分别占62.65%及75.00%。A/A型与A/S型的卵巢反应相比差异无统计学意义;而A/A型与S/S型间及A/S型与S/S型间的卵巢反应有统计学意义。见表5及封四图3。

表3 各SNP组基本情况比较 ±s

表3 各SNP组基本情况比较 ±s

组别 n 基础FSH值/(U·L-1) 年龄/岁 BMI/(kg·m-2)A/A 组 72 5.98±1.90 30.64±2.89 21.21±2.41 A/S组 21 6.03±1.21 6.21±1.42 21.24±3.49 S/S组 27 30.60±3.50 30.33±3.77 21.02±2.63 P 0.665 0.996 0.940

表4 各基因型组临床常用监测指标比较 x±s

表5 不同卵巢反应组各SNP的构成比 %

3 讨论

3.1 FSHR基因多态性

国外的研究结果认为不孕妇女的FSHR基因外显子10的680位存在基因多态性,分别为A/A、A/S和S/S 3种基因型,其中S/S或A/S型比率最高[1,7-9]。本研究发现120例不孕妇女中也存在同样的基因多态性,有3种基因型,但3种基因型在患者中所占的比率有所区别,其中A/A型最多,达到60.00%(72/120)。

3.2 不孕患者卵巢反应与各项临床指标的关系

在IVF-ET或卵浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗中,为了制定合理的COS方案,让患者获得更多有效的成熟卵泡,从而提高患者的妊娠率,减轻患者的经济和精神负担,需提前了解患者的卵巢反应性。目前常用的临床检测指标有基础FSH(bFSH)水平、基础雌二醇(bE2)值、B超下检测窦卵泡等,但都不能非常准确地预测患者的卵巢储备情况,所以人们一直试图寻找一种更好的预测方法。本研究按获卵数将患者卵巢反应由低到高分为3组,结果显示3种卵巢反应组患者的基本条件无显著性差别。3种卵巢反应类型患者间的AFC、HCG日B超监测双侧卵巢中直径≥14 mm的卵泡数、HCG日E2值有明显差别。本研究结果显示,3组患者的bFSH值差异并无统计学意义,但卵巢低反应组的bFSH水平较卵巢正常反应组和卵巢高反应组有升高的趋势。而AFC与卵巢反应成正相关,其数值越高,卵巢反应越高[10]。说明在临床常用的预测卵巢反应性的指标中,AFC比bFSH更准确。

3.3 FSHR 3种基因型与卵巢反应性的关系

FSHR基因型可能是卵巢对FSH刺激反应的重要决定因素,尤其是Asn680纯合子[8]和Ser680纯合子[10-11]。本研究结果显示不孕妇女中A/A型与S/S型患者的卵巢反应性差异有统计学意义,S/S型比A/A型患者的卵巢反应性低,提示不同基因型与卵巢的反应性可能有关。在卵巢低反应组中以S/S型为主,而A/A型则偏向分布于卵巢高反应组及卵巢正常反应组患者中;S/S基因型在卵巢低反应组中所占的比例最高,而在卵巢高反应组中所占比例最低;A/A型在卵巢正常反应组和卵巢高反应组中所占比例均最高。A/S型者在卵巢低反应组中所占比例均最低。

本研究结果显示,S/S型的获卵数与A/A型和A/S型相比有减少的趋势,但3种基因型的获卵数差异无统计学意义。该结果提示S/S纯合子基因型与卵巢低反应可能有关,这与Perez Mayorga M.等[1-12]研究的结果类似。

Perez Mayorga M.等[1,11-13]认为A/S型和S/S型患者比A/A型的FSH用药支数明显多。本研究结果显示3种基因型FSH用药量差异无统计学意义,可能与种族、地域差异及统计人数不足有关;也可能是由于FSHR的3种基因型是患者对FSH药物刺激产生不同反应的多种因素中的一种,不能作为预测卵巢反应的单一指标。

综上所述,不孕妇女FSH R外显子10的680位存在A/A、A/S和S/S 3种基因型,各基因型在不孕妇女中所占的比率不同,其中A/A型最多。卵巢低反应患者的基因型以S/S型为主,卵巢正常反应者和卵巢高反应者以A/A型为主,提示S/S纯合子基因型与卵巢低反应可能有关。如果加大病例数研究后结果仍和本研究一致的话,则提示对不孕患者FSHR基因型的检测可能可以作为预测卵巢反应的一项补充指标。随着科技的不断进步,基因多态性的检测方法会变得越来越简便和经济,通过检测患者FSHR基因多态性并结合其他的相关检测结果,可能有助于临床上不孕患者超促排卵用药方案的选择和改进,预测患者超促排卵效果,从而提高不孕患者进行IVF-ET或ICSI的成功率,为不孕患者的治疗带来福音。

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