双氢青蒿素抗肿瘤作用研究进展

汪 溪,李建业,夏春咸

(连云港市第二人民医院连云港市肿瘤医院,江苏 连云港 222006)

青蒿素及其衍生物是一类临床奏效快、治愈率高而毒性低的抗疟药物,尤其对耐氯喹或对多种药物耐药的脑型疟和恶性疟有效,因此在临床上得到广泛的应用[1]。双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin,DHA)就是青蒿素的重要衍生物之一,其分子式为C15H24O5,分子量为 284.35,具有水溶性强、抗疟活性好的特点。随着研究的深入,人们发现双氢青蒿素除了具有抗疟作用外,还具有抗炎、调节免疫、抑制瘢痕增生及抗肿瘤作用[2]。尤其是在抗肿瘤方面,抗肿瘤活性强,而对正常组织细胞的毒性很低。我们知道从天然植物中提取和筛选抗肿瘤药物是当前的研究热点之一,本文就国内外学者对其抗肿瘤作用方面的研究作一综述。

1 双氢青蒿素的抗肿瘤作用

早在 1992年孙玮辰等[3]报道了青蒿素衍生物-四种青蒿酸及青蒿 β衍生物体外对人肝癌细胞SMMC-7721和人胃癌细胞 SGC-7901均具有抑制作用,但是对正常人体细胞作用轻微,从而提示青蒿酸及青蒿 β衍生物对癌细胞杀伤作用是具有选择性的。这种选择性的杀伤作用在以后的研究中多次得到证实,如:Singh等[4]发现 DHA对正常人乳腺细胞HTB125没有明显的细胞毒作用,但是对放射抗拒的人乳腺癌细胞 HTB27却表现出了很强的杀伤作用,而且添加转铁蛋白能够提高这种杀伤能力。Jiao Y等[5]应用青蒿素的衍生物包括蒿甲醚、青蒿琥酯、蒿乙醚及双氢青蒿素作用于卵巢癌细胞及正常的卵巢细胞,发现它们可抑制卵巢癌细胞增殖,促进其凋亡,存在时间与剂量依赖性,但对正常的卵巢细胞作用轻微,其中 DHA作用最强。在体内抗肿瘤研究方面,曹智刚等[6]采用 C57小鼠 B16-BL6黑色素瘤、H22肝癌、Lewis肺癌移植瘤观察 DHA的抑瘤作用,发现其最大抑瘤率分别为 35.3%、69.7%和42.2%,呈现剂量反应关系。在 DHA 30 mg/kg给药浓度时,提前 6 h给予 FeSO45 mg/kg口服可增强DHA对 B16-BL6黑色素瘤和 H22肝癌的抑制作用。鉴于青蒿素及其衍生物的确切抗癌作用,美国国家癌症研究所(National cancer institute,NCI)已将其纳入抗癌药物筛选与抗癌活性研究计划。

2 双氢青蒿素的抗肿瘤分子机制

2.1 促进肿瘤细胞凋亡 肿瘤的发生与细胞的过度增殖及细胞凋亡受阻有关。Singh等[4]发现DHA作用于乳腺癌细胞 16 h后可观察到凋亡小体。Zhou等[7]进行了 DHA对人白血病 HL60细胞的体外抑制作用研究,应用 MTT法测定 DHA对 HL60细胞存活的影响,AO/EB双染法、DNA凝胶电泳、流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示 DHA对 HL60细胞有显著抑制作用,IC50值为1.74μmol/L,95%可信区间为 0.86-2.60μmol/L。AO/EB双染可见明显的晚期凋亡细胞核形态和染色特征。DHA1μmol/L作用 HL60细胞 48 h后可以看见典型的梯形条带,显示凋亡细胞的典型特征。不同浓度的 DHA作用作用 HL60细胞 48 h后,G1期峰前均出现了代表细胞凋亡的亚二倍体峰,呈现浓度依赖性。并且进一步通过 Western-blot等方法研究发现在此过程中Caspase-3活化,Bax表达增加,Bcl-2表达下降同时转铁蛋白受体下调,认为 DHA可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡。陈卫强等[8]的研究也表明,230 nmol/L的 DHA作用 A549细胞 24 h、48 h均可使其G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,抑制 A549细胞增殖,使其滞留在 G0/G1期,在 G0/G1期前出现亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率上升,表明 DHA抑瘤机制与诱导 A549肺腺癌细胞凋亡有关,但还有待于进一步研究其引起凋亡的途径。邵义如等[9]研究 DHA对结肠癌细胞系 SW480增殖凋亡的影响,同样发现DHA可以抑制 SW480细胞增殖,促进 SW480细胞凋亡,并通过免疫组化方法发现 DHA作用 SW480细胞 48 h后凋亡抑制蛋白 Survivin表达减弱,而凋亡效应蛋白 caspase-3表达增强,从而发现 DHA显著抑制 SW480细胞増殖,促进 SW480细胞凋亡,可能与抑制 Survivin蛋白表达,促使 Caspase-3表达增强有关。另外有研究显示,DHA诱导细胞的凋亡与细胞内 Ca2+以及 P38 MAPK信号传导通路有关[10-11]。具体 DHA是如何诱导肿瘤细胞凋亡的还有待于进一步研究,但是可以大胆推测 DHA诱导细胞凋亡与抑制及降解 NF-k B活性密切相关,多种倍半萜内酯化合物包括青蒿素类药物均可通过烷化NF-k B或阻断抑制性蛋白 kIB的降解削弱 NF-kB的活性[12]。而活化的 NF-kB可直接作用于细胞周期或 DNA复制导致癌症的发生[13],NF-kB的活化与肿瘤的发生发展密切相关[14]。

2.2 通过 Fe2+介导的直接杀伤作用 有研究认为 DHA抗肿瘤作用可能与其抗疟机制类似,需要Fe2+的参与。恶性肿瘤细胞需要大量的 Fe2+作为合成去氧核糖的原料,恶性肿瘤细胞表面存在着大量的铁转运蛋受体,所以在恶性肿瘤细胞中 Fe2+含量要比正常细胞大得多。而 DHA其铁介导的自由基生成的细胞毒作用和靶细胞内的铁水平呈正相关。Singh等[4]发现增加转铁蛋白后能够提高双氢青蒿素对人乳腺癌细胞 HTB27的细胞毒作用,而对正常的乳腺细胞没有明显的细胞毒作用。林芳等[15]研究发现外源添加 FeCl350-150μmol/L可以使 DHA对 MCF-7细胞的生长抑制率提高 30%-50%。近期研究表明,许多过表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞,如白血病细胞株 CCRF、CEM和星形细胞瘤细胞株U373,只有在应用了高剂量青蒿素,并和铁剂合用后才有一定的治疗效果[16-17]。也就是说,如果在DHA治疗肿瘤的同时,配合增加一些铁剂或者诱导转铁蛋白的表达,使肿瘤细胞内的 Fe2+水平增加,会大大提高药物对耐药肿瘤细胞的杀伤作用。

2.3 抑制肿瘤血管生成 肿瘤的浸润生长以及侵袭转移常伴有大量的新生血管的生成以保证其旺盛的营养需求。因此抑制血管的生成对抑制肿瘤生长有着重要的意义。Chen等[18-19]用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长、迁移及小管形成实验研究,发现双氢青蒿素体外可以抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和管状形成。李茵等[20]通过试验表明,DHA能够有效抑制 K562细胞的增殖,同时较低浓度 2μmol/L的 DHA就能显著抑制 K562细胞VEGF蛋白和 mRNA的表达。在对 K562细胞条件培养基促血管新生作用的进一步研究中发现,经DHA处理后,K562细胞条件培养基促的促内皮细胞增殖能力明显减弱,其在促鸡胚绒毛尿膜(CAM)血管新生研究模型中的促血管新生作用亦有所下降。也就是说 DHA不仅能够显著下调 K562细胞 VEGF的表达,而且可以抑制由其诱导的血管新生作用。从而提示 DHA具备既能抑制肿瘤细胞增殖分化,又能干扰 VEGF诱导的肿瘤血管新生的双刃作用。这一点与 Wu等[21]对多发骨髓瘤 RPMI8226细胞研究结果相类似。

2.4 放化疗协同及逆转肿瘤耐药 肿瘤耐药机制极其复杂,研究表明,可能与以下因素有关:体内药代动力学变化、药物转运外排与亚细胞分布改变、药物作用靶标如拓扑异构酶改变、DNA损伤修复加强、抗凋亡基因表达增强、细胞增殖速率变化等等。这些机制可能同时存在,不同机制间相互影响。由于青蒿素类药物与传统的化疗药物如甲氨蝶呤、长春新碱以及羟基脲等作用机制不同。因此这使得青蒿素类药物逆转肿瘤细胞对传统化疗药物的耐药性成为可能。陈卫强等[22]以人肺腺癌 A549细胞及其耐顺铂细胞株 A549/CDDP为作用对象,研究DHA体外逆转耐药作用。发现顺铂单独作用对人肺腺癌 A549细胞和 A549/CDDP细胞 IC50值分别为 0.270 g/ml和 5.703 g/ml,耐药倍数为 21.12。而DHA与顺铂联用,低剂量 DHA可部分逆转顺铂耐药,其 IC50值由 5.703 μg/ml变为 2.255 μg/ml,逆转倍数为 2.53。高剂量 DHA逆转效果更佳,经与320 nMDHA共同作用,顺铂对 A549/CDDP细胞的IC50值由 5.703μg/ml变为 0.464μg/ml,逆转倍数为 12.29,与低剂量组比较差异显著。说明 DHA对顺铂的逆转效果存在浓度依赖性。进一步研究认为其机制可能与 DHA下调 Bcl-2/Bax比例,从而解除 A549/CDDP细胞凋亡抑制有关[23]。Kim等[24]研究发现,双氢青蒿素可增加神经胶质瘤细胞U373MG的放射敏感性。其机制可能与青蒿素增加ROS生成及抑制谷胱昔肽转移酶(CST)的表达有关。Han等[25]研究发现青蒿素及其衍生物可以明显地抑制 weel激酶的活性,抑制 edc2T14和edc2Y15磷酸化,从而激活 edc2活性,抑制电离辐射诱导引起的 G2期阻滞,细胞带着损伤进入 M期发现凋亡或死亡。

3 展 望

综上所述,大量的实验结果显示双氢青蒿素具有抗肿瘤活性的特点:抑制肿瘤细胞增殖;诱导肿瘤细胞凋亡;抑制新生血管形成;逆转肿瘤细胞耐药;与转铁蛋白结合提高对肿瘤细胞的特异性杀伤;对传统的化疗药物具有增敏作用等。尽管关于双氢青蒿素抗癌作用的临床探索性研究以及关于它与肿瘤浸润转移相关因子如尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的研究较少,但是双氢青蒿素在临床抗疟治疗中具有其安全、高效、毒副作用小等特点,对我们打破传统抗癌药物的研究思路,寻找抗癌新药,抗癌新靶点具有重要意义。

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