RAPD和SRAP分子标记在绣球菌菌种鉴定中的应用*

陈瑞鹏，贾小宁，郭立忠

（青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室，山东 青岛 266109）

绣球菌 (Sparassis crispa)属于非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属[1]，称绣球覃。子实体中等至大形，肉质，形似巨大的绣球，直径10 cm～40 cm，白色至污白或污黄色。孢子无色，光滑，卵圆形至球形，4 μm～5 μm[2]。绣球菌是珍稀名贵的食药兼用菌，营养特别丰富，在西欧各国极为畅销，价格昂贵[3]。绣球菌可提高人体免疫功能，治疗心脑血管、糖尿病、高血压等疾病，长期食用可降低胆固醇、血压，能清除面部色斑、色素、雀斑、黄斑及嫩肤美容功效[4]。

随机扩增多态性DNA（RAPD)标记技术和相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术已用于食用菌的菌种鉴定、遗传育种等研究中。随机扩增多态性DNA技术成功对香菇菌株[5]、灵芝[6]、绿僵菌[7]、蜜环菌[8]等进行了遗传多样性分析、鉴定和分类。相关序列扩增多态性分子标记也在银耳菌[9]、荆半夏[10]、毛木耳[11]等菌株的遗传多样性分析中得到广泛应用。

本实验利用RAPD、SRAP分子标记技术对6个绣球菌菌株进行亲缘关系分析，对绣球菌遗传育种工作有重要的实用价值。

1 实验材料

供试菌株来源及编号情况见表1。

表1 绣球菌供试菌株

2 实验方法

2.1 DNA的提取与检测

选用新鲜菌丝体作为DNA提取的材料，0.1 g菌丝体于1.5 mL离心管中，液氮研磨。按改良后的CTAB法[12]进行DNA的提取，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的质量，紫外分光光度计检测DNA的浓度，于-20℃保存备用。

2.2 RAPD反应引物筛选

64对引物由上海生物工程公司合成，引物名称为S3～S6，S8～S21，S23～S28，S31，S32，S34～S42，S44～S50，S120～S130，S380～S384，S386，S388，S390。

64条引物分别对1号、3号、4号三个绣球菌菌株基因组DNA进行扩增，筛选合适的引物组合用于遗传多样性分析。

PCR反应体积 16 μL，各成分终浓度为：1×PCR Bufer，200 μmol·L-1dNTPs，引物各 0.4 μmol·L-1，0.625U TaqDNA聚合酶，5 ng DNA模板，最后加双蒸水补齐。扩增程序为：94℃预变性 3 min后，94℃ 30 s，35℃ 30 s，72℃ 3 min，32个循环后，72℃延伸10 min。

电泳和检测统计：2%琼脂糖凝胶电泳，恒压70 V，电泳1 h，于凝胶成像系统检测电泳结果。

2.3 SRAP反应引物筛选

应用8条上游引物和8条下游引物合成64对引物，对1号、3号、4号3个绣球菌菌株的DNA进行扩增，筛选出条带多、多态性较好的引物组合用于遗传多样性分析，RAPD引物序列编号及核酸序列情况见表2。

PCR反应体积 16 μL，各成分终浓度为：1×PCR Bufer，200 μmol·L-1dNTPs，引物各 0.4 μmol·L-1，0.625U TaqDNA聚合酶，5 ng DNA模板，最后加双蒸水补齐。循环体系采用复性变温法：94℃预变性5 min，前5个循环（94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min），后 35个循环复性温度提高到50℃，最后72℃延伸10 min。

2.4 亲缘关系鉴定

用筛选出的RAPD、SRAP引物对6个绣球菌菌株的基因组DNA进行扩增。

2.5 数据处理分析

用NTSYS-pc（2.02a）软件计算相似性系数，得相似性系数矩阵，用UPGMA法进行聚类分析，生成聚类图。

3 结果与分析

3.1 DNA提取结果

CTAB法提取DNA的检测结果如图1所示。

图1 菌株基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱

从图1可以看出，试验得到了清晰的单一总DNA条带，能为RAPD、SRAP分子标记技术的PCR扩增提供可靠模板。

3.2 RAPD多态性分析

用筛选的10条随机引物（S8、S10、S23、S25、S31、S32、S38、S40、S120、S380）对6个菌株的基因组DNA进行扩增，共扩增出257个条带，既有共有带又有特征带，其中多态性条带为245条，多态性比率为91.4%，每个引物平均获得24.5条多态性条带。DNA片段分子量大小在250 bp～3000 bp之间。引物S23、引物S32对供试菌株基因组DNA的扩增图谱见图2。

图2 引物S23、引物S32对供试菌株基因组DNA的扩增图谱

3.3 聚类分析

使用NTSYS(W)202软件对6个菌株的相似性进行聚类分析，结果见图3。

图3 绣球菌菌株的RAPD聚类分析图

供试的6个绣球菌菌株经RAPD分析表明，两两间的相似系数范围在0.439～0.981之间，说明其在遗传上相似程度不同，存在一定的亲缘关系差异。其中菌株4和菌株5的相似性系数最大为0.981，菌株2和菌株4、菌株5的相似性系数为所有菌株中较小的为0.393，菌株2和菌株1相似系数最小为0.383。由图3可知，相似性系数0.800时，6个菌株聚成4组：1号、4号、5号为1组，3号、6号、2号分别为1组。2号与其他4株亲缘关系最远。

3.4 SRAP多态性分析

筛选出的 12对引物（Me6-Em2、Me3-Em3、Me5-Em4、 Me6-Em7、 Me6-Em1、 Me3-Em8、 Me5-Em1、 Me8-Em3、 Me7-Em4、 Me3-Em5、 Me3-Em1、 Me4-Em2），扩增6个供试菌株的基因组DNA，共扩增出312条DNA条带。大部分条带分子量在200 bp～3000 bp之间，多态性条带为246条，占总条带数的78.8%，每对引物平均获得20.5条多态性条带。部分引物的扩增结果见图4。

图4 引物Me3-Em3、引物Me6-Em2对绣球菌菌株DNA的扩增图谱

3.5 SRAP聚类分析

使用NTSYS软件对6个菌株的相似性进行聚类分析，分析结果见图5。

图5 绣球菌菌株的SRAP聚类分析图

供试的6个绣球菌菌株SRAP分析表明，两两间的遗传相似系数范围0.411～0.875，表明菌株间丰富的遗传多样性，其中4号和5号的相似系数最大（0.875），亲缘关系最近，2号和4号间的相似系数最小（0.411）。由图5可看出，当相似系数为0.700时，可将6个菌株聚成4组，1号、4号、5号为1组，3号、6号、2号分别为1组。

4 讨论

本研究通过SRAP分子标记技术对绣球菌菌种进行分类鉴定，在相似系数为0.600时，SRAP标记可将6个供试菌株分为3组。在相似系数阈值为0.700时，SRAP标记可将6个供试菌株分为4组。SRAP标记在较低的相似系数水平上，就可将两亲缘关系较近菌株区分开来，所反映的遗传信息丰富，分辨率高且重复性较好。

研究表明[11]，RAPD可以快速、灵敏、准确地用于食用菌菌种的检测和鉴定。本研究对64条随机引物进行筛选，获得10个具有多态性的DNA指纹图谱，被测试的6个绣球菌菌种之间均有遗传上的差异，且综合分析，能将所有菌株区分开来。

通过对2种分子标记技术的结果分析，RAPD与SRAP分子标记技术在本实验中分别在以相似系数0.8000和0.7000为阈值时，6个供试菌株的分组是相同的，都分为4组。4号、5号同源性最大，在2种分子标记技术中相似系数分别达到了0.9813和0.8750，表明4号、5号可能是同物异名，而2号与4号相似系数很低，与其他菌株的亲缘关系最远，2种技术结果的一致性，证明2种方法能很好地用于绣球菌菌种间亲缘关系的鉴定。

由于缺乏规范的食用菌品种登记制度，绣球菌菌种同名异物、同物异名的现象普遍存在，这不仅损害了育种工作者和生产者的利益，同时也加速了菌种的退化，严重阻碍了产业的健康发展。本试验采用RAPD、SRAP方法筛选出的部分引物能有效地将6个供试菌株区分开来，从而为绣球菌菌种鉴定提供了依据，但对来源不同的菌种进行分析时，仅依据一种方法的结果具有不确定性，如果再结合子实体形态特征和其他的分子检测手段进行分析，结果将会更准确、更科学。

[1]薛道帆，周立平.绣球菌的研究开发概况[J].杭州农业科技，2008，16(3)：27-29.

[2]赖日辉.绣球菌栽培技术初报[J].浙江食用菌，2007，17(2)：47-48.

[3]Petrova RD,Wasser SP,Mahajna JA,et al.Potential role of medicinal mushrooms in breast cancer treatment:current knowledge and future perspectives[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2005,7(1):141-155.

[4]朱斗锡，何荣华.珍稀食用菌的经济价值及开发前景[J].资源开发，2009(2)：19-20.

[5]龚利娟，李玉，刘淑艳.香菇品种遗传多样性RAPD分子标记的研究[J].菌物研究，2005，23(1)：17-21.

[6]许晓燕，余梦瑶，罗霞，等.利用AFLP和SRAP标记分析19株毛木耳的遗传多样性[J].西南农业学报，2008，121(1)：121-124.

[7]秦国夫，贺伟，沈瑞祥.中国蜜环菌生物钟的RAPD分析[J].真菌学报，1996，15(1)：26-33.

[8]王淑珍，白晨.灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子基因组RAPD分析[J].食用菌学报，2003，10(1)：1-5.

[9]曲绍轩，高山.SRAP、ISSR和RAPD分子标记技术在银耳菌株鉴别上的应用[J].食用菌学报，2007，14(3)：1-5.

[10]邓瑞宁，王沫.荆半夏遗传多样性的SRAP分析[J].农业生物技术学报，2008，16(6)：1070-1071.

[11]施庆利，罗信昌.RAPD技术在木耳杂交种及原生质体融合子鉴定分析中的应用[J].中国食用菌，1994，12(6)：324.

[12]Porebski S,Bailey LG,Baum BR.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Molecular Biology Reporter,1997,15(1):8-15