虎杖苷抑制ox－LDL诱导的脂质过氧化并下调巨噬细胞清道夫受体CD36表达*

肖铭甲，陈卫红，吴 炜，郭 文，赵克森，赵 明△

(南方医科大学1第一临床医学院，2基础医学院病理生理教研室，广东省休克微循环重点实验室;3南方医院消化科，广东省胃肠疾病重点实验室，广东 广州 510515)

动脉硬化引起的心脑血管疾病严重危害人类身体健康，是人类两大致死原因之一。动脉硬化发生的早期表现是巨噬细胞大量吞噬氧化的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)形成泡沫细胞。在泡沫细胞的形成中，巨噬细胞脂代谢失调有重要的作用[1]。正常的巨噬细胞，有一个脂代谢的负反馈调节机制。它经过LDL受体吞噬LDL;而当细胞内脂质合成或吞噬的脂质过量时，LDL受体的表达和胆固醇的合成又会得到抑制，从而保护巨噬细胞避免泡沫样变。氧化的低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox－LDL)的作用则不同，它激活和诱导巨噬细胞表达清道夫受体，其中以CD36为主;经清道夫受体吞噬ox－LDL，没有脂代谢的负反馈调节机制，使巨噬细胞大量吞噬脂质从而泡沫样变，泡沫细胞在动脉壁聚集，形成动脉硬化斑块。

动脉硬化的发生率在西方约为2‰，而发展中国家的发生率，约为万分之四左右。西方的膳食结构是这个差别的主要原因。在西方国家中法国却是一个例外。尽管法国人也是西方的膳食结构，但是，法国冠心病死亡率只有美国的三分之一，称为法兰西矛盾现象(French paradox)，它与法国人喜饮葡萄酒的习惯有关。进一步的研究发现是由于葡萄皮中富含白藜芦醇的缘故[2]。白藜芦醇被证明是一种有效的抗氧化剂，它广泛存在于葡萄、花生等72种植物中。中草药中以虎杖含量最高。虎杖的提取物－虎杖苷，已经被证明具有抗休克作用，作为国家I类新药，已经进入二期临床实验。近年来，关于虎杖苷的降血脂、抗氧化功效也逐渐引起关注。明确虎杖苷降血脂以及抗氧化的机制无疑对抗衰老和预防动脉粥样硬化具有十分重要的意义。因此我们利用分子探针和流式细胞仪等手段和仪器，研究了虎杖苷抗氧化的机制和抑制巨噬细胞清道夫受体表达的效果，为虎杖苷在临床应用的进一步扩大，提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 雌性SPF级C57/BL6小鼠(18－22 g)，购自南方医科大学实验动物中心。

1.2 仪器 水平电泳仪(Bio－Rad)、流式细胞仪(R＆D)、低温超速离心机(Beckman)、恒温水浴箱(北京)、超净操作台(苏州)。

1.3 试剂 虎杖苷由深圳海王药业集团提供;普通人血浆购自南方医院血库;解离缓冲液(dissociation buffer)、CD36抗体、二氢罗丹明(dihydrorhodamine 123，DHR123)均购自Sigma;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)检测试剂盒均购自南京建成生物有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 LDL的分离与氧化修饰 用1次性密度梯度超速离心法(60000 r/min，6 h)从人血浆中分离LDL，测得蛋白浓度0.4 g/L[3]。LDL经透析膜去除溴化钠(NaBr)后，置于含5 μmol/L Cu2+的PBS中，37℃温育8 h。修饰后的 LDL加入 200 μmol/L EDTA终止反应。PBS透析24 h去除EDTA，超滤除菌后4℃保存[4]。修饰程度鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法。

2.2 动物分组及处理 将虎杖苷用生理盐水配成1.5%的溶液，小鼠腹腔注射0.2 mL/d，对照组注射等量生理盐水，连续注射3 d，第4 d停止注射，第5 d眼球取血处死，75%乙醇消毒，取腹腔巨噬细胞培养备用。

2.3 细胞培养 将提取的小鼠腹腔巨噬细胞以1×106cells/well的密度接种入24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

2.4 SOD检测 小鼠腹腔巨噬细胞，离心后超声粉碎，再离心，根据SOD试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书要求，取细胞裂解液的上清，采用黄嘌呤氧化酶法，测定细胞SOD。

2.5 LPO检测 将提取并培养的巨噬细胞给予ox－LDL(50 mg/L)刺激4 h，离心取上清并按照LPO试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书，应用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA法)，检测细胞LPO。

2.6 流式细胞仪检测呼吸爆发 小鼠腹腔巨噬细胞接种于培养基，培养12 h后洗去未贴壁细胞，向培养基加ox－LDL(50 mg/L)，刺激15 min，PBS冲洗终止刺激，用dissociation buffer洗脱细胞，清洗后用10μmol/L二氢罗丹明(DHR123)处理细胞，流式细胞仪检测呼吸爆发。

2.7 流式细胞仪检测CD36 小鼠腹腔巨噬细胞接种于培养基，培养12 h后洗去未贴壁细胞，向培养基加ox－LDL(50 mg/L)。培养24 h后，用 dissociation buffer洗脱细胞，清洗后用FITC－CD36抗体标记，流式细胞仪检测诱导情况。

3 统计学处理

用GraphPad软件对结果进行单向方差分析，数据用均数±标准差()表示。

结 果

1 虎杖苷提高小鼠腹腔巨噬细胞SOD的活性

如图1所示，虎杖组的巨噬细胞的SOD明显高于PBS组(P＜0.01)。

Figure1.Polydatin up－regulated SOD activity in peritoneal macrophages.5 ×105abdominal macrophages from indicated groups were isolated separately.SOD activities in supersonic lycate were assayed as described in the materials and methods section..n=6.*P＜0.05 vs PBS group.图1 虎杖苷显著提高巨噬细胞SOD活性

2 虎杖苷抑制ox－LDL诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发

图2A为铜离子修饰的低密度脂蛋白凝胶电泳结果。可见氧化修饰的低密度脂蛋白由于携带负电荷增加，在电场中向正极移动得较快。正常低密度脂蛋白的条带与正常小鼠血浆中的低密度脂蛋白条带重合，见图2A。图2B示ox－LDL的自由基代谢产物MDA增加，与正常的LDL有显著区别。图2C显示，ox－LDL诱导巨噬细胞呼吸爆发，而虎杖苷可以抑制这个呼吸爆发的发生，它与PBS对照组没有显著差异。

3 虎杖苷抑制ox－LDL诱导的小鼠腹腔巨噬细胞LPO的蓄积

如图3所示，PBS处理组的LPO蓄积较少，而给予ox－LDL刺激后，细胞的LPO蓄积明显增多，提示细胞的氧化应激程度较高;而虎杖注射组的巨噬细胞培养液LPO蓄积低于ox－LDL刺激组。

4 虎杖苷抑制ox－LDL诱导的小鼠腹腔巨噬细胞CD36的表达

图4显示，PBS处理组巨噬细胞表达的CD36水平较低，在给予ox－LDL刺激后，CD36表达明显增多;而虎杖苷可有效抑制ox－LDL诱导的CD36表达(PBS+ox－LDL:91.44±9.07 vs虎杖苷+ox－LDL:49.52 ±2.01)。

Figure2.Polydatin inhibited ox－LDL－induced respiratory burst in peritoneal macrophages.A:agarose gel electrophoresis result from Cu2+－induced oxidation of LDL.B:MDA assay in ox－LDL..n=6.△P＜0.05 vs PBS group.C:5×105abdominal macrophages were incubated with 50 mg/L ox－LDL for 15 min，cells from control group were incubated in standard cultue condition.DHR123 staining was assayed by flow－cytometry..n=6.#P＜0.05 vs PBS group;*P＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.图2 虎杖苷抑制ox－LDL诱导巨噬细胞呼吸爆发

讨 论

巨噬细胞的呼吸爆发(respiratory burst)主要是经两大途径产生超氧阴离子，一是激活细胞内NADPH氧化酶，一是破坏线粒体，造成线粒体损伤，线粒体内的高能电子渗漏，释放自由基[5]。氧化的LDL可以循清道夫受体及TLR2、TLR4等受体信号转导途径，激活NADPH氧化酶在胞浆中的亚基，例如磷酸化p47phox，从而使在胞浆内的亚基迁移到质膜上，组装成完整的酶复合体，发挥作用。NADPH氧化酶可以被看成是与质膜结合的微小电子传递链，它能够将分子氧通过单电子还原产生过氧化自由基()，并以此为基础形成一系列二级产物，这些产物通称活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

Figure3.Polydatin significantly reduced ox－LDL－induced LPO accumulation in peritoneal macrophages.5×105 abdominal macrophages from indicated groups were isolated，and cultured with 50 mg/L ox－LDL for 4 h.Cells in PBS control group were cultured in standard condition.Cell supernatants were assayed for LPO according to manufactures instruction(see materials and methods section)..n=6.△P＜0.05 vs PBS group;*P ＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.图3 虎杖苷明显降低ox－LDL诱导的巨噬细胞LPO蓄积

Figure4.Polydatin inhibited ox－LDL－induced CD36 expression.5×105abdominal macrophages from indicated groups were incubated with 50 mg/L ox－LDL for 24 h.Cells in PBS control group were under standard culture condition.CD36 expression was assayed by flow－cytometry..n=6.#P＜0.05 vs PBS group;*P＜0.05 vs PBS+ox－LDL group.图4 虎杖苷下调ox－LDL诱导的巨噬细胞CD36表达增高

Figure5.Schematic diagram for the inhibitory target of polydatin in ox－LDL－induced macrophage foam cell formation.① Polydatin inhibited ox－LDL－induced respiratory burst in macrophage;② Reactive oxygen species formation;③ Up－regulated SOD activity and protected mitochondria，inhibited activation of MAP kinases and PPARγ transactivation on the regulation of CD36 expression;④ Inhibition of macrophage uptake lipids and foam cells formation.图5 虎杖苷抑制ox－LDL诱导泡沫细胞形成的可能靶点示意图

这些活性氧的产生可进一步攻击线粒体膜上的脂质，使其过氧化而破坏线粒体膜的稳定结构，造成线粒体高能电子和氧自由基的释放。线粒体呼吸链由4种复合物组成，其中复合体III的Q循环中Qo位点中半醌自由基(UQH·)已明确是的单电子来源。已有报道证明，白藜芦醇可以抑制线粒体复合物III产生的超氧阴离子[6]，因而白藜芦醇具有抑制巨噬细胞呼吸爆发产生两大途径的双重功能。我们的结果显示，虎杖苷对抑制氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞呼吸爆发及自由基产生具有十分显著的作用。

细胞内的抗氧化系统包括抗氧化剂和抗氧化酶两部分。虎杖苷作为抗氧化剂本身具有一定的抗氧化能力，但是它对抗氧化酶表达和功能的调节则具有十分重要的意义。SOD是生物体内重要的抗氧化酶和清除自由基的首要物质。它催化如下反应:+2H+→H2O2+O2，因而它可以淬灭NADPH氧化酶产生的以及线粒体渗透出来的超氧阴离子为过氧化氢和氧气，从而阻断氧自由基对细胞的损害[7]。我们的研究发现，虎杖苷能够增强SOD的活性，从而淬灭巨噬细胞激活产生的氧自由基，阻断自由基作为第二信使的进一步反应。

自由基在细胞内发挥第二信使的作用，诱导细胞作出一系列的氧化应激反应，例如细胞骨架的改变，细胞因子的表达释放和细胞膜蛋白受体的表达，包括清除氧化低密度脂蛋白的清道夫受体CD36等[8]。CD36是巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白的主要受体。Febbraio等[9]用CD36基因敲除小鼠来研究其在动脉粥样硬化形成过程中的作用。他们发现，与对照组相比，敲除CD36基因后，小鼠的腹膜巨噬细胞对ox－LDL的结合和摄取能力显著降低。在有关人巨噬细胞的研究中也发现，CD36基因的表达对ox－LDL的结合和摄取有一定的影响。在亚洲人群中检测到CD36基因的多态性，该基因多态性可导致CD36表达缺陷(NAKa－表型)。与正常对照组的细胞相比，这些病人体内分离出来的单核细胞源性巨噬细胞与ox－LDL和胆固醇酯的结合减少了40%，这进一步表明了CD36是 ox－LDL的生理性受体[10]。CD36/apoE双基因敲除鼠(DKO)喂饲高脂饮食后，小鼠的主动脉斑块面积减少了70%，文献报道[11]CD36是致动脉粥样硬化脂质的主要受体。我们以往的研究证明，ox－LDL诱导的CD36表达是经过MAPK激酶通路调节的。ox－LDL激活p38蛋白激酶，而p38蛋白激酶抑制剂特异而有效地阻断ox－LDL诱导的CD36的表达。进一步的研究显示，p38蛋白激酶是通过调节PPARγ的活性调控CD36的表达[12]。因此，氧化应激对CD36的表达有重要的调节作用。本文的结果显示，虎杖苷有抑制ox－LDL诱导CD36表达的作用，这其间的主要机制是它的抗氧化功能起作用，其下调CD36的机制可能也包括阻滞MAPK家族成员对PPARγ(CD36调控的关键蛋白)的磷酸化作用。我们的后续工作会对此问题继续进行深入的研究。

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