不同时间EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果研究

王 湛 周 玲 杜海军 叶树青 尉秀霞 曾 毅

非复制型腺病毒载体具有安全性高、宿主范围广泛、感染滴度高、易于重组基因操作、稳定性好、产生的大量外源蛋白接近于翻译后水平的成熟蛋白质等优点。应用腺病毒载体携带目的基因，通过表达产物的生物活性或通过激发机体的免疫应答达到治疗疾病的目的。非复制型腺病毒载体已经被广泛的应用到临床中，利用非复制型腺病毒载体表达p53基因的重组腺病毒rAd-p53已经上市，成为世界上第一个基因治疗药物。

本研究目的是观察携带EBV-LMP2基因的重组腺病毒在小鼠特内诱导特异性CTL的时间规律。

1 材料与方法

1.1 病毒、试剂

重组腺病毒Ad-LMP2本实验室提供；EBV-LMP2肽库由北京中科亚光生物科技有限公司合成；ELISPOT试剂盒为荷兰U-Cytech公司产品；EZ-SepTMMouse 小鼠淋巴细胞分离液由达科为生物技术有限公司提供；Biosys Bioreader 4000 PRO自动读板仪等。

1.2 实验动物

4～6周雌性Balb/C小鼠，SPF级，共30只。中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供（实验动物生产许可证：SCXK-（军）2007-004）。

1.3 剂量分组

每只小鼠均免疫2×109VP Ad-LMP2重组腺病毒。

1.4 动物免疫方法

使用1mL注射器，于小鼠胫前肌内注射给予动物，0.1mL/点，分别设0、1、2、3、4、5周，共6个实验组，每组5只小鼠。为了尽量减少检测误差，采用不同时间点免疫小鼠，同一时间检测的方案。具体方法为每周购入5只4～6周雌性Balb/C小鼠免疫Ad-LMP2，第6周时购入新的小鼠作为0周对照。1.5 ELISPOT分析

按照动物免疫方案，6周时各组小鼠统一分类脾淋巴细胞，依小鼠IFN-γ-ELISPOT分析试剂盒说明书进行检测，特异刺激物为LMP2混合多肽。ELISPOT板每孔中分别加入2×106细胞液100μL，100μL混合多肽刺激IFN-γ的释放，每种多肽的使用浓度为10μg/mL，只加入100μL培养基不加多肽的细胞孔做自身阴性对照。37℃，5%CO2条件培养36h，依说明进行斑点染色，ImmunoSpot计数。

2 结 果

使用LMP2多肽刺激Ad-LMP2免疫的不同时间点小鼠脾淋巴细胞，ELISPOT方法检测释放细胞因子IFN-γ的细胞占脾淋巴细胞的比率。结果显示，在免疫1周的小鼠1×106脾淋巴细胞中，可以检测到约800个LMP2特异性释放IFN-γ的细胞，随着免疫后时间的延长，与免疫后1周的结果相比较，免疫后2、3、4周时小鼠脾淋巴细胞中LMP2特异性释放IFN-γ的细胞的比率没有明显改变，5周时略有降低，见表1和图1。

表1 小鼠脾淋巴细胞中释放γ-IFN细胞数（1×106脾淋巴细胞）

3 讨 论

Epstein-Barr（EB）病毒属于疱疹病毒科γ亚科，在人类广泛传播，为95%以上的成人所携带。EBV与多种人类肿瘤相关，包括鼻咽癌（NPC）等恶性肿瘤，EBV的存在为疫苗及免疫治疗的研究提供了理想靶位。NPC是我国南方一些省（自治区）的常见恶性肿瘤之一，与EBV健康携带者相比，NPC患者体内针对EBV蛋白的CTL反应明显降低，在正常人、IgA/VCA抗体阳性人群、鼻咽癌病人体内，LMP2的特异性CTL水平呈依次下降趋势[1,2]。

图1 Ad-LMP2免疫后不同时间小鼠脾淋巴细胞中释放γ-IFN细胞数（1×106脾淋巴细胞，与1周时结果比较 *为P＜0.05）

介导肿瘤相关抗原基因转移的方法包括病毒载体及理化方法等多种途径。腺病毒、痘病毒、逆转录病毒是最常用的病毒载体，尤其是腺病毒载体目前认为是最有前景的病毒载体。在全世界已开展的基因治疗临床试验中，约70%使用了病毒载体，其中逆转录病毒载体和腺病毒载体使用最多，分别达27%和26%。由于腺病毒载体突出的安全性特点及比逆转录病毒载体稍大的外源基因容量，在Ⅱ/Ⅲ期或Ⅲ期临床试验中，54%使用了腺病毒载体[3]。世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒rAd-p53已经上市，rAd-p53被用于头颈部鳞癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、脑瘤、支气管肺泡癌等的临床研究中。重组腺病毒感染细胞后，病毒基因组DNA以附加子方式存在，不整合入宿主基因组，病毒基因组不复制，但可以持续表达基因蛋白。吴丹莉等[4]利用表达绿色荧光GFP的重组腺病毒研究病毒的分布，结果表明，通过局部注射的方式免疫动物，注射第3天时GFP荧光最强，第7天荧光开始减弱，第14天时消失，表达持续时间不超过3周。研究发现，只在注射局部检测到重组病毒，而在肝、肺、脾、肾、脑和睾丸等部位没有发现，病毒在注射局部不扩散，没有造成全身性分布，表明应用重组腺病毒在治疗中更加安全。

本试验观察了携带EBV-LMP2基因的重组腺病毒在小鼠体内诱导产生的针对LMP2特异性CTL应答随时间的变化情况，为以腺病毒做载体，以提高机体相关的细胞免疫水平为目的的基因药物的临床免疫方案的制定提供依据。

[1]彭朝晖,张晓志.国外重组腺病毒-p53制品对肿瘤基因治疗临床研究的概况[J].中华医学杂志,2003,83(23):2098-2100.

[2]周玲,姚家伟,陈志坚,等.免疫斑点法检测特异性EB病毒潜伏膜蛋白2合成肽的细胞毒T淋巴细胞[J].中华实验和临床病毒学杂志,2000,14(4):384-385.

[3]Mo WN,Tang AZ,Zhou L,et al. Analysis of Epstein-Barr virus DNA load,EBV-LMP2 specific cytotosic T-lymphocytes and levels of CD4CD25T cells pn patients with nasopharyngeal carcinomas positive for IgA antibody to EBV viral capsid antigen[J].Chin Med J,2009,122(10):1173-1178.

[4]吴丹莉,张友荣,劳妙芬,等.腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对大鼠心肌缺血的基因治疗[J].科学通报,2002,47(22):1726-1729.