冰冻切片技术联合免疫组织化学在胸腹水细胞诊断中的应用研究

蔡晖滔

胸腹水是临床上多种疾病，特别是肿瘤性疾病的常见伴发体征，临床上胸腹水的性质对于疾病的诊断有较大的价值，常将胸腹水送病理检查。一般病理检查通常离心、涂片、HE染色进行病理诊断，但由于细胞分散、染色效果不好、重复性差等原因，诊断的阳性率较低，易漏诊。尤其是增生的间皮细胞和转移性腺癌；未分化癌与小细胞癌和淋巴瘤之间不易区别，疑诊病例较多，对临床帮助不太大[1]。我们将胸腹水离心进行冰冻切片常规HE染色，同时进行相应免疫组织化学标记，明显提高了胸腹水细胞诊断的阳性率及准确性。该方法可重复性高，细胞清晰，能明确诊断，部分病例能明确肿瘤的类别和来源，有重要的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

我们从2006年5月至2007年12月共收集我院胸腹水标本64例，其中胸水44例、腹水20例，男性38例、女性36例，年龄35～86岁，平均年龄52岁。

1.2 方法

1.2.1 将送检的胸腹水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30mL于试管内、离心10min，2500r/min。将上清液去掉，离心沉淀物涂片1张、HE染色。沉淀的部分放在冰冻切片机的冷冻头上，然后加人OCT包埋剂进行切片。

1.2.2 胸腹水离心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰冻切片机的冷冻头上加人OCT包埋剂，然后将胸腹水离心沉淀物放在上面进行切片。

1.2.3 胸腹水离心沉淀物常规切片6张：1张HE染色、5张免疫组织化学染色。

1.2.4 制作免疫组织化学染色的冰冻切片必在冷藏保存，然后根据需要进行免疫组织化学染色。

1.2.5 免疫组织化学染色

免疫组织化学我们标记的CK、EMA、LCA、间皮细胞、Vimentine。免疫组织化学染色方法：采用即用型快捷免疫组织化学MaxvislonTm试剂盒，试剂及抗体和免疫组织化学阳性片由福建迈新生物技术公司提供，阴性对照采用PBS作为一抗。

其染色步骤如下：①切片实温干燥后，入4℃丙酮固定10min，用PBS（pH：7.4）冲洗3次，每次3min（3×3）。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复，除细胞角蛋白用胰酶消化外，间皮细胞、Vimentin、LCA、EMA都要柠檬酸高温修复（按说明操作）。③每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10minPBS洗（3×3）。④每张切片加1滴自选1抗体，室温下孵育60min。⑤PBS冲洗3×3，除去PBS液每张切片加1滴即用型试剂，室温下孵育10分钟，PBS洗3×3。⑥除去PBS液，每张切片加2滴新配制的DAB溶液10min。⑦自来水洗，苏木素复染直致中性树胶封固。

2 结 果

送检的64例胸腹水直接离心涂片HE染色诊断阳性细胞7例，阴性40例，可疑阳性18例。应用冰冻切片技术联合免疫组织化学检查结果阳性细胞24例，阴性38例。可疑阳性仅2例，见表1和表2。

表1 64例胸腹水单纯涂片与冰冻切片HE片诊断结果

表2 64例胸腹水冰冻切片切片免疫组织化学标记结果

3 讨 论

胸腹水是临床上多种疾病的首发体征，正确诊断明确胸腹水性质对正确治疗有重要意义。临床上常将送检的胸腹水单纯离心涂片HE染色光镜下病理诊断，但由于细胞分散、染色效果不理想，又因细胞容易堆积成团，难以明显诊断，其诊断的阳性率较低，特别是小细胞肿瘤难以和间皮瘤、淋巴瘤、未分化肿瘤细胞之间难以区别，给诊断带来困难。我们采用冰冻切片技术联合免疫组织化学在胸腹水细胞诊断中的应用，明显提高了阳性细胞的检出率，由于冰冻切片技术是将胸腹水离心、加入OCT后常规冰冻切片、HE染色，细胞结构清楚、重复性好，还可作免疫组织化学标记、大大提高了胸腹水细胞诊断的准确性，免疫组织化学标记又能准确的定位肿瘤细胞的表达的抗原，确定肿瘤细胞属性及来源，特别是对分化差的肿瘤的病理诊断或肿瘤类型的确定中起到重要的鉴别作用，在难病例中诊断中，对明确肿瘤类型起着重要的指导意义。不仅有助于良、恶性的判断而且对常规涂片中难以鉴别的间皮细胞和转移性腺癌的识别有重要的参考作用[2]。

同时免疫组织化学在鉴别间皮细胞和转移腺癌时，因为间皮细胞具有双向分化的特点，因此上皮性抗原不标记（EMA）但间叶性标记vimentin有不同程度的阳性，而癌细胞则呈单一性上皮抗原阳性，vimentin常为阴性。间皮细胞：主要分布在间皮细胞中，其他腺上皮一般不表达，主要用于恶性间皮瘤的的诊断，在鉴别诊断时，恶性间皮瘤的阳性部位应为细胞膜，而其他腺癌多为胞浆阳性，在观察时应注意，Vimentin：作为一个阳性对照是很好的标记物，在非肿瘤性上皮组织中很容易表达作为内对照。EMA：上皮膜抗原对内脏腺上皮的表达优于细胞角蛋白，因此，对上皮源性肿瘤，尤其是低分化癌最好细胞易角蛋白联合应用。CK：细胞角蛋白用于鳞癌、腺癌、小细胞癌、恶性间皮瘤部分滑膜肉瘤，平滑肌肉瘤，可疑阳性抗原，在鉴别诊断中EMA进行上皮性肿瘤与非上皮性肿瘤的鉴别。LCA主要用于淋巴瘤与未分化小细胞癌的鉴别[3]。因此，冰冻切片技术及免疫组织化学联合检测胸腹水细胞有重要的应用价值。

但在操作中值得注意的几个问题：①冰冻切片不能太厚，一般4μm连续切片，同时应使用粘胶片，切片后如果不染色，必须吹干，冷藏保存。②在胸腹水细胞离心沉淀少的情况下，倒去上清应该先在冷冻头上放OCT然后再将胸腹水细胞离心沉淀物放在上面切片。③如果血性胸腹水，可加入0.5%氯化氨溶液离心去除红细胞效果比较好。④在采集胸腹水时最好使用一次性吸管吸取下面沉淀部分，胸腹水应新鲜。⑤免疫组织化学观察时应注意，胞浆和细胞核阳性的差异，特别是恶性间皮瘤阳性部位在胞膜部分，免疫组织化学还可根据病例不同选择相宜的抗体。

[1]刘梦海,梁忠泉,袁昌隆,等.痰液和胸腹水沉积物切片在肿瘤脱落细胞中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2003,19(4):409.

[2]丁华新,何向蕾,陈培辉.免疫细胞化学在胸腹水细胞学鉴别诊断中的应用[J].临床病理学杂志,2002,99 (4) :220 .

[3]罗庆丰,谢梅,高玟,等.冰冻切片及免疫组织化学技术在胸腹水细胞诊断中的应用[J].实用癌症杂志,2007,22(4):363.