黄芪总黄酮对佐剂性关节炎模型大鼠IL-4、IFN-γm RNA表达影响的研究*

陕西中医学院(咸阳 712046)杨晓航 史传道 叶峥嵘 贾文鹏

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病,目前认为辅助性 T细胞(Th)亚群 Th1与 Th2及其分泌的细胞因子平衡紊乱和失调是 RA发病的重要因素[1]。黄芪总黄酮(Flavonoids of ast ragalus,TFA)是中药黄芪茎叶中提取的有效成分中含量较高的一类单体组分。本次研究是在前期 TFA对 Th1与 Th2相关细胞因子白介素 4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)血清含量影响的研究基础上[2],进一步开展的 TFA对模型大鼠外周血单个核细胞(PBMC)分泌的 IL-4、IFN-γ转录水平影响的研究。

材料与方法

1 实验动物及分组 Waster大鼠 30只,雄性,10～12周龄,体重约 150～180g,购自第四军医大学实验动物中心。将 30只大鼠随机分为正常组、模型组、实验组(治疗组),每组 10只。

2 主要仪器与试剂 PCR扩增仪(美国 ABI公司 2720型扩增仪),凝胶图像分析系统(美国 Bio-Rad公司);Trizol(Invitrogen公司),逆转录酶 M-MLV试剂盒 (美国 GIBCO),Taq DNA聚合酶、d NTP(Promega公司),RPMI1640(Hy Clone产品 ),淋巴细胞分离液(d=1.083,中国医学科学院生物医学工程研究所生产),引物由上海生工生物公司合成。TFA由成都科伦药物研究所提供,完全弗氏佐剂(FCA,购自美国 GIBCO),DNA Marker为 DL2000(宝生物公司 )。

3 动物模型制备及处理 适应性喂养 3 d后,在乙醚轻度麻醉下,用微量注射器于右后足跖皮内注射环磷酰胺(FCA)0.1 ml,约 14 d左右可诱发成功佐剂性关节炎模型[3]。模型组:上法造模成功后,第 15 d生理盐水灌胃 3 m1/次,1次 /d,连续 14 d;治疗组:上法造模成功后,TFA 250mg/kg体重灌胃,3 m1/次,1次/d,连续 14 d;正常组:适应性喂养结束后,用生理盐水灌胃 3m1/次 ,1次 /d,连续 28 d。

4 外周血 PBMC分离方法 在超净台中,按无菌操作分离 PBMC细胞。步骤如下:①取 1 ml肝素锂抗凝血与 1 ml RPM I1640充分混匀;②在干净的空离心管中加入 2 ml淋巴细胞分离液;③沿管壁缓慢将①中稀释血 2 ml叠加于分层液面上,保持界面清楚;④2 000 r/min水平离心 15min后,吸取单个核细胞层,置入另一离心管中;⑤加入 5倍体积的 RPMI1640,1 500 r/min离心 10min;⑥弃去上清后,悬浮细胞,加入RPM I1640,再次 1 500 r/min离心 10min;⑦弃上清,悬浮细胞,加入 RPMI1640定容至 1 ml;⑧用RPM I1640将细胞悬液浓度调整到 2×106个 /ml。 所获细胞悬液用于 PBMC总 RNA的提取。

5 总 RNA制备及逆转录反应 见参考文献[4,5]。

6 PCR反应 在 50μl反应体系中,包括 10×PCR缓冲液 5μl,50mM MgCl2 2.5μl,10mM d NTP 1μl,10uM上下游引物(见表 1)各 2μl,DNA Taq酶 0.4μl,cDNA 4μl,灭菌双蒸水 33.1μl,充分混匀 ,简短离心。 反应条件:95℃ 5min,94℃30s,62℃ 30s,72℃45s,共 35个循环,再于 72℃延伸 7min。同时以 β-actin作内参照,扩增产物用 15g/L琼脂糖凝胶电泳进行,电泳的电压为 6V/cm,溴化已啶(EB)染色 20min后凝胶图像分析系统下成像观察并拍摄。

表1 PCR引物 β-actin、IL-4及 IFN-γ的引物序列[6]

7 RT-PCR凝胶图像分析 应用 Quantity One软件(Bio-Rad,USA)进行表达强度分析。结果的判断以图像分析软件读取的目的电泳带灰度值与内参照βactin条带的比值作为目的基因 mRNA的表达量,按下列公式计算:mRNA的表达量(相对强度 relative value,RV)=目的条带灰度值 /β-actin条带灰度值[7]。

结 果

大鼠外周血单个核细胞表达 IL-4mRNA、IFN-γ mRNA逆转录后再 PCR扩增后电泳结果如附图所示,扩增产物均符合预期片段大小,内参照条带清晰稳定。从图中我们可以看到,模型组 IL-4 cDNA经扩增后条带亮度低于正常组和实验组,而实验组条带亮度略低于正常组。从 IFN-γ表达情况来看,模型组条带亮度强于正常组和实验组,实验组略强于正常组。利用Quantity One软件分析各组条带灰度值,然后通过与内参照比较,公式计算其相对定量结果,从表 2我们可以看到模型组大鼠外周血单个核细胞 IFN-γmRNA的表达明显高于正常组(P＜0.05),经用药治疗后,实验组明显降低,与模型组比较呈显著性差异(P＜0.05)。大鼠外周血单个核细胞表达 IL-4mRNA的表达模型组显著低于正常组(P＜0.05),治疗后实验组升高,但与模型组比较无显著性差异。

讨 论

大量研究证实,类风湿性关节炎患者滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核 /巨噬细胞、淋巴细胞等通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的细胞因子和炎性介质,这些分子相互作用形成了一个细胞因子网络,其中任何一个环节都可能对类风湿性关节炎的病理过程产生重要的影响,而参与类风湿性关节炎的致病过程[8]。类风湿性关节炎属中医痹证之顽痹、骨痹及历节病等范畴。

附图 各组 IL-4m RNA表达和 IFN-γm RNA表达

表2 黄芪总黄酮对 IL-4、IFN-γm RNA表达的影响()

表2 黄芪总黄酮对 IL-4、IFN-γm RNA表达的影响()

注:与正常组比较*P＜0.05;与模型组比较**P＜0.05;

分组 n IL-4mRNA IFN-γmRNA正常组 10 1.32± 0.79 0.98± 0.61模型组 10 0.79± 0.46* 1.54± 0.57*实验组 10 1.02± 0.91 1.17± 0.98**

临床常见症状有关节肿胀疼痛,晚期严重可引起关节强直、畸形,功能严重受损。黄芪为中医传统的益气药,有补气升阳,固表止汗,利尿消肿,托疮生肌的功效。多数治疗类风湿性关节炎的组方中,均有大剂量的黄芪[9],可见黄芪在类风湿性关节炎中的治疗作用是得到肯定的。黄芪总黄酮是从中药黄芪茎叶中提取的有效成分中含量较高的组分。现代药理作用研究表明,它可增加 T细胞总数及提高 IL-2所诱导的 LAK细胞活性[10];同时对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用可能与其降低血清 LPO及滑膜细胞产生的 IL-1和 NO有一定相关性[11],但以往涉及 Th1与 Th2细胞亚群平衡紊乱研究较少。 IFN-γ和 IL-4分别是 Th1、Th2细胞分泌的特征性因子,Th1及 Th2细胞通过它们控制下游效应细胞的活性。促炎性 Th1细胞及其分泌的 IFN-γ和抗炎性 Th2细胞及其分泌的 IL-4的失衡,是 RA发病的的重要机制[12]。 IL-4在 RA中的作用,一是促进巨噬细胞黏附到血管内皮细胞上,然后逸出血管,沿趋化梯度移动到炎症部位;二是通过促进 Th2细胞扩增,抑制 Th1细胞介导的免疫应答,从而抑制 RA患者体内异常的免疫反应。正常机体的 IFN-γ能阻断 IL-4对 B细胞的增殖作用,此外 IFN-γ具有抑制 B细胞的活化作用[13]。本研究通过黄芪总黄酮调节 Th细胞亚群平衡紊乱,旨在探究类风湿性关节炎与 Th1/Th2偏移的相关性和中药治疗类风湿性关节炎的免疫学机制。实验结果显示造模组外周血中 Th2细胞因子表达与对照组比较较低,Th1细胞因子较高,Thl/Th2平衡向 Thl偏移,细胞因子平衡状态受到破坏,结果与文献报道相符,证实类风湿性关节炎与 Th1细胞因子有一定相关性。治疗组外周血中 Th2细胞因子表达与造模组比较较高,而 Th1细胞因子与造模组比较降低但无显著性差异,表现为 Thl/Th2平衡的 Thl偏移得到纠正,对纠正 RA的炎性损害有利。综述以上研究结果显示黄芪总黄酮具有纠正 RA大鼠外周血中 Th1/Th2平衡偏移的作用,而达到防治 RA的目的。

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