脂肝清冲剂对实验大鼠非酒精性肝炎影响的实验研究

西安市第八医院 (西安 710061) 马羽萍 叶峰 赵玲 彭杰 罗改云 黄小正 王勇

临床研究提示,脂肝清冲剂能改善脂质代谢和肝功能,有一定的抗脂肪性肝炎的作用。为此,我们设计了本实验,旨在探讨脂肝清冲剂对实验大鼠非酒精性肝炎的影响。

材料与方法

1 实验动物 实验选用 SPF级健康 8周龄Wistar大鼠,雌雄各半,体重 180±10g,均购自西安交通大学医学院实验动物中心。

2 实验材料 脱氧胆酸钠(中国医药(集团)上海化学制剂公司进口分装);总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、检测试剂盒(上海科欣生物技术研究所生产);丙硫氧嘧啶购自国药集团化学试剂有限公司;胆固醇购自西安沃尔森生物技术有限公司;所有中药材均购自西安交通大学医学院第一附属医院中药房。

3 实验方法

3.1 试剂配制:中药脂肝清的主要成分:黄芪、杜仲、山萸肉、当归、醋柴胡等,按照各药在各方中的比例准确称取,混匀,加入 10倍量水,浸泡 6 h后加热煎煮1 h,滤出药液,再加入 8倍量水,煎煮 1 h,过滤,将两次煎煮所得药液合并,水浴浓缩为含生药 1.50g/ml的液体,灭菌 4度保存,冰箱储存备用,用时微温。

3.2 动物模型制备:参照王倩等方法[1],建立了大鼠非乙醇性脂肪肝模型。实验动物适应性饲养 1周后,随机分为 A、B、C、D共 4组。 其中 A、B、 C组是实验组;D组是正常对照组。 A、B、C实验组以改良的高脂饲料(胆固醇 2%,胆酸钠 0.5%,丙硫氧嘧啶 0.2%,蔗糖 5%,猪油 10%,基础饲料 82.3%)喂养 8周,自由饮用清水。正常组以全价营养颗粒饲料喂养,饮自来水。实验第 8周造模结束。实验室温度(21～23)℃,相对湿度 50%～60%。

3.3 分 组:将大鼠称质量后按体质量大小编号,根据随机数字表随机分成:正常对照组、模型对照组、中药治疗组(1g/kg),古拉定(还原型谷胱苷肽 )治疗组。每组各 15只。各治疗组从实验第二天起灌服药物,模型对照组灌服生理盐水 1ml/100g,正常对照组灌服等量生理盐水。

3.4 观察及检测内容:①观察实验过程中大鼠的精神状态、活动情况、毛发光泽度、食欲、大小便情况等。②心脏采血,分离血清,测量 TG、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)。③肝匀浆测定:处死大鼠后迅速取出肝脏,在相同的部位称取肝右叶 500mg,置于预冷的异丙醇中冰浴匀浆为 10%的匀浆液,4℃静置抽提 48h后离心,取血清用酶法测定TG、TC。④光镜下观察:于实验第 8周末处死实验动物。10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)后称重,常规消毒后,剖腹取大鼠左、右叶肝组织各一块,大小约 1cm×1cm×1cm,常规石腊包埋切片、HE染色(由于肝细胞内的脂滴在制片过程中被脂溶剂所溶解,故 HE染色的切片中脂滴呈空泡状);并使用美国 AO公司 Histo STAT856型冰冻切片机,在-18℃下进行冰冻切片,切片厚度为 9μm。用 70%酒精洗去冰冻切片的水分,滴入苏丹Ⅲ染料 20～30min,用 70%酒精洗去多余染料,水洗,水洗至胞核显蓝色;滴入封片剂封固。脂肪呈橙红色或鲜红色,胞核呈蓝色。于光学显微镜下观察结果。-:无变性肝细胞;+:变性肝细胞占视野＜1/3;++:变性肝细胞占视野 1/3～2/3;+++变性肝细胞占视野＞2/3。模型组与正常组比较,P＜0.05,中药组与模型组比较,P＞ 0.05。

结 果

1 一般情况 造模结束时,正常对照组大鼠饮食、精神和活动状态良好,体重持续增长。脂肪肝模型组大鼠在实验过程中皮毛蓬乱而无光泽,精神萎靡、食欲不振、饮水减少、体质量下降,大便稀溏,对刺激反应迟钝,有互相撕咬、攻击现象。西药治疗组大鼠反应稍差,精神欠佳,个别出现溏便,体质量增加较缓慢。中药治疗组皮毛光泽,行动灵活,进食量正常,个别体质量增加较缓慢,大鼠反抗力增强。

2 肝湿重及肝指数(肝湿重 /体重× 100%)变化情况 正常组和模型组大鼠体重明显增加,但是中药组和西药组大鼠体重明显减轻,差异均有显著性意义(P＜0.05)。模型组、中药组和西药组大鼠的肝脏重量均有增加的趋势,但仅模型组明显高于正常(P＜0.05),中西药组肝脏重量与模型组比较有降低趋势,但与正常组间比较无显著性差异。模型组大鼠的肝指数显著高于体重相似的正常组(P＜0.05),其余各组肝指数各组间无显著性差异 (见表 1)。

表1 肝湿重及肝指数()

表1 肝湿重及肝指数()

注:*P＜0.05与正常组比较;△P＜0.05与模型组比较

组 别 n 大鼠体重(g) 肝湿重(g) 肝指数正常组 15 412.1± 24.1 8.9± 1.2 2.8± 0.2模型组 15 419.2± 22.5* 9.9± 0.9* 3.3± 0.2*中药组 15 388.3± 24.8* 9.5± 1.5 2.6± 0.2西药组 15 385.3±28.7 9.1±1.4△ 2.7±0.2

3 血清中生化指标的变化 模型组大鼠血清ALT、AST、TC及 TG水平均显著升高(P ＜0.05)。而同模型组相比,西药和中药治疗组大鼠血清 ALT和AST水平显著降低(P＜0.05),而中药与西药治疗组血清 ALT和 AST水平之间未见明显差异 (P＞0.05),与模型组比较,中药及西药组对 TC及 TG水平均无明显变化。见表 2。

表2 血清中生化指标的变化()

表2 血清中生化指标的变化()

注:P＜0.05与正常组比较;△ P＜0.05与模型组比较。

组 别 n ALT(U/L) AST(U/L) TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常组 15 67.5±10.3 78.8±35.4 50.7±0.3 0.9± 0.1模型组 15 113.2±15.2* 180.1± 33.4* 84.4± 1.4* 2.1± 0.4*中药组 15 84.1± 12.1△ 92.2±23.5△ 78.2± 1.1* 2.3± 0.2*西药组 15 85.3± 13.3△ 76.5±21.1△ 80.1± 0.8* 2.2± 0.1*

4 组织中 TC,TG水平的变化 肝组织中模型组大鼠 TC和 TG水平明显升高(P＜0.05),中药组和对照组用药后 TG水平下降,但之间无差异,且仍高于正常且有显著性差异(P＜0.05)。

表3 组织中 TC,TG水平的变化()

表3 组织中 TC,TG水平的变化()

注:P＜0.05与正常组比较;△ P＜0.05与模型组比较

组 别 n TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常组 15 1.2±0.1 1.6± 0.3模型组 15 3.4± 0.3* 2.2± 0.7*中药组 15 2.6±0.3*△ 1.8±0.4*西药组 15 2.2±0.2*△ 1.6±0.5*

5 肝脏组织病理分析

5.1 大体观察:造模结束后,正常对照鼠肝脏为红褐色,形态正常,表面光亮,中等硬度,切面略有颗粒感,无油腻感;模型组大鼠多数肝脏表面颜色发黄,肝脏体积明显增大,包膜紧张,部分肝脏呈奶黄色,切面油腻,有油滴,无颗粒感;中药组大鼠肝脏较正常组偏大,大部分颜色红润,个别淡黄色,切面略有颗粒感,无油腻感;西药组大鼠部分肝脏肥厚,红黄相间,个别切面油腻,有油滴。

5.2 光镜下观察结果:①正常组大鼠肝细胞小叶结构清晰,肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状分布,肝细胞排列紧密整齐,大小均匀,未见异常增多的红染脂滴;②模型组大鼠肝细胞中度水肿,结构紊乱,多数肝细胞胞浆内可见弥漫性大小不等、数量不一的红染脂滴,以小叶中央区受累明显,严重的融合为大脂滴,将细胞核挤向一边,形似脂肪细胞;③中药治疗和西药治疗组:大鼠肝细胞较正常略大,均较模型组有不同改善。仅有一些细小脂滴散布于肝小叶周边的细胞内,偶见汇管区少量淋巴细胞和浆细胞浸润。

5.3 各组大鼠肝组织 HE染色肝细胞脂肪变性分级比较:模型组,中药组,西药组大鼠变性肝细胞数半定量均比正常组明显增多(P＜0.05)。中药,西药治疗组大鼠变性肝细胞数半定量均比模型组明显减少(P＜0.05),但二者经统计学分析差异尚无显著性(见表4)。

表4 各组大鼠肝组织 HE染色肝细胞脂肪变性分级比较

5.4 各组大鼠肝组织苏丹红Ⅲ染色脂滴半定量分析比较:苏丹红Ⅲ染色结果:镜下观察肝组织脂肪经苏丹红Ⅲ染色,模型组大鼠肝细胞变性以大泡性脂滴为主,中药及西药组大鼠肝细胞变性则以小泡性脂滴为主。中药治疗组脂滴明显比模型组西药组少,其分布面积经图像分析系统的半定量分析差异有显著性意义(P＜0.05),见表 5。

表5 各组大鼠肝组织苏丹红Ⅲ染色脂滴半定量分析比较

讨 论

脂肪肝系由多种原因引起的肝脏脂肪性病变。其中非酒精性脂肪性肝病是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。本研究采用高胆固醇、高脂肪饲料喂养大鼠是目前较为理想的脂肪肝造模方法,其主要特点是人为干扰因素少,饮食结构接近人类日常的饮食,因而研究结果更具有说服力[2]。本研究造模 8周后,模型组大鼠肝组织的小叶结构紊乱,肝细胞变性,细胞体积增大,苏丹红染色提示肝细胞中有大量脂滴浸润,证实形成了脂肪肝的病理改变。脂质代谢异常是脂肪肝发生、发展的主要特征[3]。模型组大鼠的肝指数显著高于体重相似的正常组,提示肝脏增大。同时除肝组织 TC、TG浓度和血清 TC、TG含量外,血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性均比正常组明显增高。以上实验结果提示本文复制的模型存在脂肪肝的炎性损伤。脂肝清治疗后肝组织 TC、TG浓度和血清 TC、TG含量,以及反映肝脏炎症的血清ALT、AST活性均明显下降,这可能是脂肝清治疗脂肪肝有效的原因之一。本研究结果表明,造模同时给予脂肝清冲剂及西药治疗,能够有效地抑制模型大鼠的体重和肝重的增加。其中西药组大鼠肝脏的湿重较模型组明显减少;以及中药,西药组大鼠的体重均有所下降,且明显低于正常组,其意义和原因还有待于进一步的探讨。中药治疗组的肝细胞变性分级程度轻于模型组,虽然中药组肝组织 HE染色肝细胞脂肪变性分级较西药组无显著性差异,但经过苏丹红Ⅲ染色的图像半定量分析结果显示,中药治疗组大鼠肝脏油红染色面积明显小于模型组,差异显著。这提示脂肝清能有效减轻大鼠肝组织的脂肪浸润。本研究 HE染色镜下对肝组织内脂肪含量的仅能进行半定量分析,具有一定的片面性,不能准确反映脂肪肝总体的状况。而利用图像技术对形态学标本进行定量分析的方法,结果具有客观、准确的优点。这可能是造成两种病理观察结果差异的原因。这表明脂肝清能有效预防非酒精性脂肪肝的形成。

[1] 王倩,管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改进.世界华人消化杂志,2007,11:1219-1224

[2] 周海涛,洪振丰.脂肪肝的动物模型研究进展.福建中医学院学报,2008,02:68-71

[3] 温秀梅,陈芝芸,严茂祥,何蓓晖.大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成中脂质代谢的变化.中华中医药学刊,2008,9:1987-1989