妊娠相关血浆蛋白A定量测定方法的建立*

李灵俊 陈淑莲 李向东 彭学静 李会强 王学谦

妊娠相关血浆蛋白A（pregnancy－associated plasma protein A，PAPP－A）是1974年由 Lin等首次从孕妇血清中分离出的一种来源于胎盘组织的糖蛋白，在外周血中以PAPP－A/proMBP异构聚合体的形式存在[1]。PAPP-A是孕早期筛查唐氏综合征的敏感指标[2]，在心血管疾病的诊断和预后判断方面也具有一定价值，研究显示PAPP-A参与血管的修复过程及动脉粥样硬化损伤的进展,并与斑块的不稳定性和破裂密切相关[3]。本文采用生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素微孔板间接包被法[4]，将标记有生物素的抗PAPP－A抗体作为捕获抗体，结合抗原；标记有辣根过氧化物酶的抗PAPP－A抗体作为检测抗体，即形成微孔板－生物素化抗体－抗原－酶标抗体的复合物，建立外周血PAPP-A定量酶联免疫测定方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 PAPP-A酶免测定试剂盒（美国DRG 公 司 ，EIA-2397，96T，LOT：46K128）； 单 克 隆 抗 体PAPP-A（10E1）0.5 g/L，PAPP－A（10E2）2．0 g/L，芬兰 Hytest公司，4℃保存；96孔酶标反应板（美国Costar公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、生物素（biotin，B）、链霉亲和素（streptavidin，SA）、牛血清白蛋白（BSA）、四甲基联苯胺 （3，3′，5，5′－tetramethylbenzidine，TMB） 均购自美国Sigma公司，规格分别为 P8125－50 kU、B4639－1 mg、40945－1 mg、A7030－500 g、T4444－100 mL。血清标本分别为 2009 年4—5月取自天津市王顶堤医院的8～14周孕妇血清60份；2008年12月取自天津市中心妇产科医院的孕晚期（≥37周）孕妇血清50份，分装，－20℃冻存，孕周以末次月经确定。酶标分析仪（DNM－9602，北京普朗新技术有限公司）；洗板机（EL×50，美国 BioTek Instruments公司）；自动包被机（B2080905，北京楠华科技开发有限公司、北京拓普分析仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 酶标反应板的制备 取生物素化牛血清白蛋白（BBC，浓度为 10 g/L），用包被缓冲液稀释1∶3 000，每孔 150 μL，室温过夜。弃除包被液，用BBC稀释液洗涤2次，每孔150 μL，每次 10 min。加入链霉亲和素，工作浓度为 1∶4 000，每孔150 μL，室温2 h。弃除包被液，甩干，加入封闭缓冲液，每孔250 μL，室温2 h。甩干备用。

1.2.2 生物素化抗体的制备 将待偶联的抗PAPP-A抗体以适当浓度溶解于0.1 mol/L碳酸氢钠溶液（pH＝9．5）中充分透析，期间换液数次；将活化生物素以适当浓度（通常为20 g/L）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中。将生物素缓慢、逐滴加到搅拌中的抗体溶液中，在室温下搅拌1 h。在4℃下用0.1 mol/L，pH＝7．4 的磷酸盐缓冲液（PBS）透析 24 h，其中换液数次，充分除去未结合的游离生物素，以1∶1的比例加入贮存液，分装，4℃保存。通过实验测试工作浓度为1∶4 000。

1.2.3 酶标抗体的制备 采用改良过碘酸钠法标记。抗PAPP-A抗体于0.3 mol/L碳酸盐缓冲液中冷藏透析过夜；取出透析后抗体加入已活化的HRP，避光，搅拌，反应1 h。于平衡液（0.01 mol/L的PBS）中冷藏过夜透析酶结合物粗品。取出已透析酶结合物，上样于已平衡好的Sephadex G-200凝胶柱，用平衡液洗脱，收集，即为纯化的酶标志物。用0.45 μm的滤膜过滤除菌，以1∶1的比例加入贮存液，分装，4℃放置备用。经实验测试工作浓度为1∶4 000。

1.2.4 标准品的制备 孕晚期混合孕妇血清，以所购试剂盒进行测定，确定血清标本浓度，使用标准品稀释液配制系列标准品，浓度分别为 50、25、10、5、2.5、1 、0 mg/L。

1.2.5 操作步骤 血清标本按1∶16稀释，生物素化抗体及酶标抗体最佳工作浓度均为1∶4 000。根据生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附试验（ELISA）放大检测系统[5]结合本文，操作步骤如下：BBC微孔板内加入10 μL标准品、待测样品，同时加入100 μL生物素标记抗PAPP-A抗体，37℃水浴反应30 min后洗板甩干；每孔加入100 μL酶标记抗PAPP-A抗体，37℃水浴反应30 min；加入显色液A、B各50 μL，避光，室温反应15 min，加入终止液50 μL，立即以630 nm作为参考波长，测定450 nm处的吸光度（A450）。DRG试剂盒测定按说明书进行。

1.3 方法学鉴定实验

1.3.1 灵敏度 对0 mg/L标准品进行10次重复测定，计算其吸光度（A）值的均值（x）、标准差（s），用标准曲线反算出其x+2 s对应的浓度值，即为本试剂盒的灵敏度。

1.3.2 准确度 采用回收实验测定。向2份已知不同浓度标准血清中分别加入2份不同浓度的临床血清标本，测定其PAPP－A含量，计算回收率。回收率＝（测定值－原PAPP－A浓度）/加入PAPP－A浓度×100%。

1.3.3 稳定性 将试剂盒放置37℃温箱，分别于第0、3、5、7天取出，进行检测，通过标准曲线变化观察其稳定性。

1.3.4 精密度 用3份正常人血清配制成低、中、高浓度质控血清，每个质控血清平行做10孔，在同一块酶标板中测定它们的浓度，测批内变异；采用相同方法分别于不同酶标板中测定它们的浓度，测批间差异，观测其精密度。变异系数（CV）=s/x×100%。

1.3.5 特异性 配制1 mg/L PAPP-A标准品，测定其A值，作为对照。同样，于标准品稀释液中分别加入绒毛膜促性腺激素（β-HCG）、泌乳素（PRL）、甲胎蛋白（AFP）、雌二醇（E2）等，观察各物质达到同样A值的加入量，计算交叉反应率（交叉反应率=各物质加入量/PAPP-A量×100%）。

1.3.6 2种方法测定结果的比较 分别采用本文所建立方法和美国DRG公司试剂盒对30份早孕血清进行检查，采用相关性分析对2种检测方法的测定结果进行比较，以观察这2种方法是否有差异，若2种方法无差异，说明相关性较好。

1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件包进行直线相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测定方法的灵敏度 同时测定10次0 mg/L标准品，用标准曲线反算出其A值的x±2 s对应的浓度值，得出该方法的灵敏度为0.31 mg/L。

2.2 准确度 回收实验结果示其回收率均在95%以上，说明此方法具有很好的准确性，见表1。

表1 不同浓度标本的回收率

2.3 稳定性 稳定性实验显示，在37℃温箱中放置3 d与0 d无明显变化，5 d后标准品A值均有所下降，但线性良好，不影响测定，说明试剂盒的稳定性良好。放置7 d后，最大A值较低，且线性较差，见图1。

图1 试剂盒稳定性

2.4 精密度 低浓度检测结果的CV不大于10%，高浓度和中浓度检测结果的CV在10%左右，说明实验方法具有良好的重复性，见表2。

表2 不同浓度血清的批内与批间变异

2.5 特异性 用本方法检测 β-HCG、PRL、AFP、E2达到1 mg/L的PAPP-A相同A值所需加入量及交叉反应率，见表3。

表3 试剂盒交叉反应率

2.6 2种方法测定结果的比较 2种方法测定30份标本，以美国DRG公司试剂盒所测得PAPP-A浓度为X轴，本文方法测定浓度为Y轴，绘制散点图，见图2。对2个变量进行相关性分析，r=0.982（P ＜0．01）；回归方程为：Y赞＝2．286 1＋1．026 9 X。本文方法与美国DRG公司试剂盒方法高度相关，该方法可用于人外周血PAPP-A含量的测定。

图2 DRG公司试剂盒所测结果与本文方法测定结果相关散点图

3 讨论

PAPP-A是从孕妇血清中分离出来的大分子糖蛋白，作为孕早期筛查唐氏综合征的一种单项血清标志物，其测定具有特别重要的意义[6]。目前国内用于定量测定人体外周血PAPP-A含量的国产试剂盒较少，主要依赖国外进口。测定方法有金标法、ELISA、时间分辨、化学发光等。金标法属定量或半定量的方法，灵敏度、特异性较后三者低，后两者准确性及特异性较高，但速度慢，且设备昂贵，成本相对较高，不易在基层医疗机构推广使用[7]。直接包被微孔板ELISA法虽操作简单、成本低廉，特异性较强，但仍需进一步提高其灵敏度。而本文采用生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被微孔板，牛血清白蛋白来源方便包被方式简单；亲和素可预包被在微孔板内，然后再将生物素化抗体包被于孔内，从而解决了一些抗体不易包被的难题。有研究表明，通过这种间接包被模式可最大限度减少包被抗体的空间位阻效应，提高抗体的利用效率，减少其用量，降低实验成本[8]。同时，这种包被模式具有较好的稳定性，可延长酶标反应板的效期，在此基础上建立的人外周血PAPP-A含量ELISA测定法操作直接简便、费用低廉，筛查范围广，灵敏度较高，值得推广使用。

综上，本文采用间接包被技术所建立的人外周血PAPP-A固相酶联免疫测定方法灵敏、可靠、稳定性好，与国外同类试剂的测定结果之间相关性较高,可望替代同类进口试剂盒进行PAPP-A含量测定、联合β-HCG检测及超声胎儿颈半透明度测量用于孕早期唐氏综合征的筛查。同时，作为易损斑块有价值的标志物，测定PAPP-A可望对急性冠脉综合征患者的危险度分层提供有效的帮助。

[1] 徐龙芳,张新安,朱佩强.PAPP-A在孕早期唐氏综合症筛查中的应用[J].临床和实验医学杂志,2006,5（10）:1632-1633.

[2] 付小国,王素媚,王燕华.孕早期血清AFP、β-HCG、PAPP-A联合检测的产前筛查意义[J].中国优生优育,2009,15（2）:108-110.

[3] Sean CH,Robert DS,Conover CA.Genetic deletion of pregnancyassociated plasma protein-A isassociated with resistance to atheroscler otic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice challenged with a high-fat diet[J].Circ Res,2007,100（12）:1696-1702.

[4] 房国祥,吴云娟,王书侠.应用生物素-链霉亲和素放大ELISA系统检测抗环瓜氨酸肽抗体[J].临床检验杂志,2009,27（1）:20-23.

[5] 祝军,张景海.生物素-亲和素ELISA法对ANEPⅢ寡核苷酸适配子亲和力的定量测定 [J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23（6）:580-582.

[6]闫卫东,张霞.21-三体综合症及其产前筛查的研究现状和发展方向[J].生物学通报,2005,40（9）:17-19.

[7] 唐宁,唐柳巧.酶联免疫吸附试验在产前筛查中的应用[J].实用医技杂志,2007,14（2）:173.

[8] 孔令青,李勇,高洪.生物素-亲和素标记技术[J].动物医学进展,2008,29（4）:100-102.