植物中药IHA-01抑制人肺癌GLC细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

王苗，董坚，李秋恬，吕加令，武治国，毛剑锋

作者单位：650032 昆明医学院第一附属医院生物治疗中心



植物中药IHA-01抑制人肺癌GLC细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

王苗，董坚，李秋恬，吕加令，武治国，毛剑锋

650032 昆明医学院第一附属医院生物治疗中心

初步探讨植物中药 IHA-01 抑制人肺癌 GLC 细胞增殖及诱导其早期凋亡的作用。

人肺癌 GLC 细胞经不同浓度（0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）IHA-01 作用24、48、72 h，以MTT 法进行 IHA-01 有效作用浓度筛选并确定IHA-01 工作浓度（1/2 IC50）；透射电镜观察 IHA-01 细胞超微结构；流式细胞术进行 DNA 倍体分析和 TUNEL 分析，检测 IHA-01 对肺癌 GLC 细胞周期及早期凋亡的影响。

IHA-01 工作浓度（1/2 IC50）为 0.7 μg/ml，且不同浓度 IHA-01 作用不同时间对 GLC 细胞增殖的抑制作用呈时效和量效依赖关系；透射电镜发现 IHA-01 实验组部分细胞出现细胞连接消失，微绒毛消失，胞质密度增加，可见细胞早期凋亡改变，具有诱导细胞分化和早期凋亡的作用；流式细胞术显示肺癌 GLC 细胞出现明显的凋亡峰，细胞周期阻滞在 G0/G1期，S 期细胞减少；流式细胞术 TUNEL 法检测结果显示，细胞凋亡和坏死同时存在。

IHA-01 具有抑制肺癌 GLC 细胞增殖，诱导凋亡的作用，具有深入研究的价值。

中草药； 肺肿瘤； 细胞增殖； 细胞凋亡

许多抗癌药物可以诱导癌细胞向终末阶段分化、重新启动细胞凋亡程序，从而抑制肿瘤细胞增殖，自主清除恶变的细胞，达到抑制肿瘤生长的目的[1]。天然植物新药 IHA-01 是从云南一种天然植物提取物中精制出的抗肿瘤活性成分水朝阳内酯，具有活血祛瘀、消肿散结之功效。云南民间用其治疗消化道癌、肺癌、乳腺癌等[2-3]，但尚未见科学报道。在以抑制肿瘤细胞增殖活性为指标进行体外抗肿瘤谱筛选时，我们发现 IHA-01 对多种肿瘤细胞株具有较强的杀伤能力。在此基础上，本研究以人肺癌 GLC 肿瘤细胞株为研究对象，初步探讨 IHA-01 抑制人肺癌 GLC 细胞增殖和诱导凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 RPMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司；新生牛血清（NBCS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；依托泊苷（VP16）购自江苏恒瑞医药股份有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；流式 TUNNEL 试剂盒为美国 Backman Coulter 公司产品；IHA-01 由本课题组委托中科院昆明植物所提取。

1.1.2 细胞株 个旧肺腺癌细胞 GLC 由本研究室进行传代培养。

1.1.3 主要仪器 Thermo3111 型二氧化碳培养箱购自美国 Themo 公司；BHC-1300IIA2 型生物安全柜购自中国苏州苏净安泰空气技术有限公司；YY3009000 型培养基过滤器购自美国 Millipore 公司；Epicsxl-4CIR 型流式细胞仪购自美国 Backman Coulter 公司；TMS-F 型倒置显微镜购自日本 Nikon 公司；Bio-Rad550 型酶标板自动读数仪购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肺腺癌细胞 GLC 用含 10% 100 g/L 灭活新生牛血清（NBCS）、100 万U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素的 RPMI1640 培养液重悬后，置于 37 ℃、体积分数 5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每 2 d 换液 1 次。

1.2.2 改良 MTT 法[4]研究 IHA-01 对 GLC 细胞增殖的抑制作用 取对数生长期的肺腺癌 GLC 细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，接种于 96 孔培养板，90 μl/孔。调整细胞终密度为 1 × 105/ml，每组设 5 个复孔，实验重复 3 次。待细胞生长12 h 完全贴壁后再分别加入对照组和 IHA-01 实验组，10 μl/孔。对照组：每孔加入 DMSO 液，终浓度为 0.01%；IHA-01 实验组：分别加入终浓度为 0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 的 IHA-01。置于培养箱分别培养 24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 液 10 μl，4 h 后加入三联液 90 μl/孔，再置于培养箱培养 24 h 后观察不同浓度的 IHA-01 在不同作用时间对肺腺癌细胞 GLC 的增殖抑制作用。酶标仪于 570 nm 波长处测定各孔吸光度（570）。细胞抑制率公式如下：

细胞抑制率（%）=（对照组平均－实验组平均）/对照组平均× 100%。

通过软件求出 IHA-01 最佳作用时间的半数抑制浓度 IC50。后续实验均采用 1/2 IC50作为 IHA-01 的工作浓度。

1.2.3 透射电镜观察超微结构 收集对照组和加入工作浓度的 IHA-01 实验组的细胞悬液置于 4 ℃环境中，离心半径 4 cm，500 r/min 离心 10 min，收集细胞 5 × 106/ml，用 PBS 冲洗 2 次，将细胞悬浮于 3.5% 的戊二醛中固定 1 h，PBS 洗 2 次，再在 1% 锇酸中固定 1 h，用丙酮梯度脱水；将细胞置于丙酮-包埋剂（1:1）中置换 30 min，然后在包埋剂中浸泡 2 h，按常规包埋、切片。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期的改变 分别收集工作浓度的 IHA-01 及 10 μg/ml 的阳性对照药 VP16 作用 48 h 的 GLC 细胞，70% 的冷乙醇固定过夜（4 ℃），37 ℃处理 1 h，用碘化丙啶（PI）对样本 DNA 荧光染色，应用 Epicsxl-4CIR 流式细胞仪检测：每个样品收集 1 × 104个细胞，然后用 Coultwincycle 软件做 DNA 分析。

1.2.5 流式细胞仪 TUNEL 法检测早期细胞凋亡 分别收集工作浓度的 IHA-01 及 10 μg/ml 的 VP16 作用 48 h 的 GLC 细胞，调整细胞数为 1 × 106/ml，按照试剂盒说明书作标记后上机检测，采集后用 Wincycle DNA 分析软件分析 FL3单门中的周期，得出 G0/G1期、G2/M 期、S 期的细胞生长特点。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度 IHA-01 作用不同时间对 GLC 细胞增殖的抑制作用

0.01、0.1、1、10、100 μg/ml IHA-01 作用 24、48、72 h 后，对 GLC 细胞增殖均有不同程度的抑制作用（< 0.05），并呈时效和量效依赖关系，见表 1 和图 1。

表 1 不同浓度 IHA-01 作用 GLC 细胞不同时间的生长抑制率（%，）

注：*与Δ比较，< 0.01；▲与24 h比较，< 0.05

Notes:*Compared withΔ,< 0.01;▲Compared with 24 h,< 0.05.

图 1 不同浓度 IHA-01 作用不同时间对 GLC 细胞增殖抑制作用的量效曲线图

Figure 1 Dose-effect curve of GLC cell proliferation effect in different time and concentration by IHA-01

2.2 IHA-01 作用 GLC 细胞 48 h 的半数抑制浓度 IC50

不同浓度 IHA-01 作用于 GLC 细胞 48 h 后，GLC 细胞生长抑制率在12.95% ~ 93.10%之间，用 IC50计算软件得到 IHA-01 作用于 GLC 细胞 48 h 后半数抑制浓度 IC50为 1.33 μg/ml。以 IC50的 1/2，即 0.7 μg/ml 作为后续实验中 IHA-01 的工作浓度。

图 2 肺癌 GLC 细胞培养 24 h 后的透射电子显微镜形态学观察（A：对照组，× 5 000；B：对照组，× 25 000；C：0.7 μg/ml 实验组，× 8 000；D：0.7 μg/ml 实验组，× 10 000）

Figure 2 Morphology observation after lung neoplasms GLC cell culture 24 h transmission electron microscopes (A: control group, × 5 000; B: control group, × 25 000; C: experimental group 0.7 μg/ml, × 8 000; D: experimental group 0.7 μg/ml, × 10 000)

表 2 FCM 分析 IHA-01 对 GLC 细胞周期的影响（%，）

注：IHA-01 组与空白组相比，＊/△< 0.05

Notes：IHA-01 groups compare with control groups,＊/△< 0.05.

2.3 IHA-01 对 GLC 细胞作用的超微结构观察

24 h，对照组 GLC 细胞生长良好，细胞表面微绒毛样突起较多，细胞核大而不规则，核分裂像常见，细胞分化较低，细胞器少、幼稚，细胞核质比较大，为恶性肿瘤细胞的形态特征（图 2A，2B)。IHA-01 作用 GLC 细胞 24 h 后：部分细胞出现细胞连接消失，微绒毛消失，胞质密度增加，细胞器增多，核染色质浓缩成 2 个或几个大的团块边聚于核被膜下，可见药物有诱导细胞分化和早期凋亡的作用（图 2C，2D）。

2.4 FCM DNA 倍体分析 IHA-01 作用 GLC 细胞周期的影响

IHA-01 作用肺癌 GLC 细胞 48 h 后，FCM 检测其细胞周期的改变，从表2 中可知，IHA-01 作用 GLC 细胞 48 h，G0/G1期细胞聚集，S 期的细胞数量减少，阻滞了 G2/M 期的转换，显示干扰了 GLC 细胞在细胞周期中的进程；与空白组相比< 0.05，有统计学差异。

2.5 FCM TUNEL 法检测 IHA-01 作用 GLC 细胞 48 h 诱导早期凋亡

FCM TUNEL 法检测 IHA-01 作用 GLC 细胞 48 h 后，出现细胞早期凋亡，IHA-01 组和 VP16 组其凋亡率和坏死率均比对照组高，有统计差异性（< 0.05）；IHA-01 组和 VP16 组比较，凋亡率无显著性差异（表 3）。

表 3 FCM TUNEL 法分析 IHA-01 作用 48 h对 GLC 细胞早期凋亡影响（%）

注：IHA-01与对照组比，＊/△< 0.05

Notes：IHA-01 groups compare with control groups,＊/△< 0.05.

3 讨论

肿瘤目前仍是临床难以治疗的疾病之一，对人类的健康危害很大，现在临床治疗肿瘤的主要方法是手术、化疗、放疗，一方面给患者带来生存的希望，同时也给患者带来较大创伤。多年来众多学者一直在寻找有效治疗恶性肿瘤的药物，尤其是筛选高效、低毒、低成本的天然植物药物倍受生物学和医学界的关注，其中从植物中提取并利用中药诱导肿瘤细胞凋亡已成为一条很有希望治疗肿瘤的新途径[5]。

依托泊苷（VP16）是一种用于临床一线的化疗药，它通过抑制细胞周期促使癌细胞凋亡而发挥抗癌作用[6]，VP16 为拓扑异构酶II抑制剂，对癌细胞 S 期末期及 G2期细胞有较强杀伤作用，属于周期特异性药物[7]。用 VP16 作为阳性对照药与 IHA-01 作比较的流式检测结果表明：IHA-01 可以干扰 GLC 细胞在细胞周期中的进程，对癌细胞的 S 期细胞有明显杀伤作用，可能与干扰了癌细胞的 DNA 合成有关；而 VP16 组 G2/M 期细胞减少，细胞聚集在 G0/G1期，因此，若 IHA-01 与特定杀灭该细胞周期的抗肿瘤药物联用，其抑制肿瘤细胞生长的作用可能会更加显著。

目前采取药物的联合应用抑制癌细胞的增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡是当前肿瘤治疗的重要方向[8]。我们通过透射电镜进行观察，IHA-01 处理组可见部分细胞核分裂像以及细胞早期凋亡改变，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，呈新月形，细胞器多，有诱导细胞分化和早期凋亡的作用。流式细胞仪的 TUNEL 检测有利于发现早、中期的 DNA 断裂，可以在凋亡的早期阶段细胞还没有出现形态学改变时检测出细胞凋亡，具有灵敏度高的特点[9-10]。流式 TUNEL 检测结果显示：IHA-01 具有早期诱导 GLC 细胞凋亡的作用，IHA-01 作用 GLC 细胞 48 h 后，在细胞中同时存在凋亡和坏死，这与Sõti 等[11]认为的细胞坏死和凋亡同时存在相符。

实验结果显示，中药 IHA-01 能有效抑制人肺癌 GLC 细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及特异性阻滞细胞周期的作用。我们推测 IHA-01 抑制 GLC 细胞增殖、诱导凋亡作用可能涉及一系列癌基因、抑癌基因转录及转录后水平的改变，其作用的分子机制尚需深入研究；由于通过诱导细胞凋亡，启动凋亡程序从而抑制细胞增殖是一个由多阶段、多系统参与的极其复杂的过程，在此仅初步讨论了 IHA-01 在体外对人肺癌 GLC 细胞株增殖的影响，我们将进一步分离、鉴定 IHA-01 的活性成分，全面系统研究其在动物体内抗肿瘤的作用，为将其开发成为抗癌新药奠定实验基础。

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An experimental study of plant traditional Chinese medicine IHA-01 suppressing lung neoplasms GLC cell multiplication and inducing its apoptosis

WANG Miao, DONG Jian, LI Qiu-tian, LV Jia-ling, WU Zhi-guo, MAO Jian-feng

Author Affiliation: Department of Biotherapy Center, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming, 650032, China

To explore the proliferation-inhibiting and the early apoptosis- inducing activity of traditional Chinese medicine IHA-01 on human lung neoplasms cell line GLC.

After being treated with different concentrations of HIA-01 (0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml and 100 μg/ml, respectively) for 24, 48 and 72 hours, the effective working concentration and its working concentration (1/2 IC50) were detected by MTT. Observed the cell ultrastructure in each group by TEM. Apply the FCM DNA assay and TUNEL assay to examines the influence of IHA-01 which induce the lung neoplasms GLC mitotic cycle and the early apoptosis process.

IHA-01 work concentration (1/2 IC50) was 0.7 μg/ml, the inhibition effect of IHA-01 on the GLC cell growth showed time-effect dependence and dose-effect dependence. The results of TEM found that some cells’ connection disappeared and microvilli disappeared, cytoplasm density increased, and the change of cell nuclear and early apoptosis was appeared in dealing with IHA-01. FCM assay indicated that most of the cells were arrested in G0/G1and the apoptotic peak appeared and the number of S phase cells decreased. The results of TUNEL indicated that there were apoptosis and necrosis simultaneous.

IHA-01 can inhibit lung neoplasms cell proliferation and induce apoptosis in vitro, and has the deep research value.

Drugs, Chinese herbal; Lung neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.005

DONG Jian, Email: dongjian18@yahoo.com

云南省应用基础研究计划（2007C0008R）

董坚，Email：dongjian18@yahoo.com

2009-12-22