BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐剂作用

赵爱华，李凤祥，贾淑珍，寇丽杰，乔来艳，王国治



BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐剂作用

赵爱华，李凤祥，贾淑珍，寇丽杰，乔来艳，王国治

100050 北京，中国药品生物制品检定所细菌一室

探讨免疫佐剂 BCG-CpG-DNA 对 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗的作用。

将不同剂量（5、10、100 µg）的免疫佐剂 BCG- CpG-DNA 与 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗直接混合后，皮下免疫小鼠，与未添加佐剂疫苗比较，ELISA 法检测抗原特异性 IgG 抗体水平，并分析抗体亚类 IgG1 和 IgG2a 的水平。

BCG-CpG-DNA 能提高 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗特异性抗体 IgG 水平，并能促进抗原特异性抗体亚类的产生，其中佐剂中、高剂量（10、100 µg）实验组 IgG、IgG2a 水平与未加入免疫佐剂疫苗之间差异有统计学意义。

BCG-CpG-DNA 对 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗有免疫佐剂作用。

BCG-CpG-DNA； 免疫佐剂； A 群脑膜炎球菌多糖疫苗

近年来，CpG-DNA 成为新型免疫佐剂的研究热点[1-10]。除了人工合成的 CpG 寡核苷酸（CpG ODN），原核生物 DNA 是 CpG-DNA 的主要来源。BCG-CpG-DNA 是从卡介苗（BCG）中提取的菌体 DNA 片段，已经证实 BCG-CpG-DNA 富含未甲基化CpG 基序，具有免疫刺激活性[11-12]，对重组的乙肝表面抗原蛋白有免疫佐剂的作用[13-14]。

由于BCG-CpG-DNA 对蛋白质抗原有免疫佐剂的作用，通过检测 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗的抗原特异性抗体水平及其亚型的类别转换，探讨BCG-CpG-DNA 对多糖抗原是否具有免疫佐剂作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

SPF 级 BALB/c 小鼠8~ 10 周，雌性，由中国药品生物制品检定所动物中心提供。BCG-CpG- DNA 由中国药品生物制品检定所菌苗室提供。A 群脑膜炎球菌多糖疫苗为上海生物制品研究所产品；96 孔酶标板为美国 Costar 公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a 为美国 Southern Biotechnology Associates.Inc 产公司品。酶标仪为美国 BD 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及免疫 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗与不同剂量的BCG-CpG-DNA 混合，总体积100 µl，头背部皮下免疫 BALB/c 小鼠，每组12 只，对照组为未添加佐剂的单纯疫苗组。多糖疫苗注射量为2.5 µg 每只动物，佐剂低、中、高剂量组分别为5、10、100 µg 每只动物，隔 1 周免疫，共免疫 3 次。

1.2.2 抗多糖抗体及抗体亚型检测 末次免疫后 7 d，摘眼球取小鼠血液，离心1500´，15 min 分离血清，ELISA 法检测多糖特异性 IgG 抗体及 IgG 抗体亚型。A 群脑膜炎球菌多糖疫苗包被96 孔酶标板，1 µg/100 µl/孔，4 ℃过夜，1% 牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h，加入待检测血清，37 ℃作用 2 h，洗板，加入 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃作用 1 h，OPD 显色适当时间，用 2 mol/L H2SO4终止反应并测定吸光度（492）值。

1.3 统计学处理

所有数据均采用Minitab 统计软件处理，< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗原特异性多糖抗体 IgG 水平

BCG-CpG-DNA 对 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗产生抗原特异性抗体 IgG 的影响见图 1，添加BCG-CpG-DNA 的各组抗体水平普遍高于未添加佐剂组，随着佐剂剂量的增加，对应的抗体水平也升高。添加 5、10、100 µg 佐剂的 3 个实验组抗原特异性的 IgG 水平分别是未添加佐剂组的1.56 倍（0.3870/0.2485）、1.83 倍（0.4545/0.2485）和1.89 倍（0.4700/0.2485），添加 5 µg BCG-CpG- DNA 疫苗组抗体水平与未添加佐剂组之间无统计学差异（= 0.15），添加 10 µg BCG-CpG-DNA 疫苗组抗体水平与未添加佐剂组之间有统计学意义（= 0.034）；添加 100 µg BCG-CpG-DNA 疫苗组抗体水平与未添加佐剂组之间有统计学意义（= 0.000）；3 组添加佐剂组之间的抗体水平无较大差异。

图 1 ELISA 法检测 BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的抗原特异性 IgG 抗体水平的影响

Figure 1 Effect of level specific antibody IgG of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine by ELISA

*：10、100 μg BCG-CpG-DNA 佐剂组的 IgG2a 水平分别与未添加佐剂组比较，有统计学意义（P = 0.0081，P = 0.0048）

Figure 2 Effect of level specific antibody IgG1 and IgG2a of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine by ELISA

2.2 抗原特异性多糖抗体 IgG 亚型

抗原特异性多糖 IgG 抗体亚型检测结果见图 2，添加 BCG-CpG-DNA 后诱导的抗原特异性的 IgG1 抗体水平与未添加佐剂组之间并无统计学意义（> 0.05）。但添加 BCG-CpG-DNA 的各组的 IgG2a 的水平均高于未添加佐剂组，并且随着佐剂剂量的增加，IgG2a 的水平也升高，添加 5 µg BCG-CpG-DNA 疫苗组的 IgG2a 水平略高于未添加佐剂组，但添加 10、100 µg BCG-CpG-DNA 两组的 IgG2a 水平与未添加佐剂组之间有统计学意义（< 0.01）。

3 讨论

本研究结果表明，BCG-CpG-DNA 能提高 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗特异性 IgG 抗体水平，虽然增加的幅度不是特别明显，但说明该佐剂对A 群脑膜炎球菌多糖疫苗具有免疫佐剂作用；这种结果也表明，佐剂和抗原的配比可能不是十分合适，还需要进一步的实验验证。抗原特异性多糖抗体 IgG 亚型检测结果表明，BCG-CpG-DNA 对多糖特异性 IgG1 抗体无较大的影响，但对多糖特异性 IgG2a 抗体有较明显的影响，但相对蛋白类抗原（如乙肝重组蛋白抗原）[10]，BCG-CpG-DNA 对多糖抗原的佐剂作用相对较弱。

免疫佐剂的主要作用是增强免疫反应或减少抗原用量，对 BCG-CpG-DNA 免疫佐剂的研究，除了要研究其有效性，还要研究其通用性，本文通过 BCG-CpG-DNA 对 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗免疫佐剂作用，联系前期对乙肝重组蛋白抗原的佐剂作用，用以说明该佐剂对蛋白和多糖类抗原均有佐剂作用，是对其有效性及通用性研究的一部分。根据目前的研究结果，100 µg BCG-CpG-DNA 添加到 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗中，产生的抗体水平是单纯疫苗组的 1.9 倍，接近 2 倍，理论上在 A 群脑膜炎球菌多糖疫苗中添加佐剂，可以减少抗原用量，若应用于实际，理论上会产生更多的经济效益。另外 BCG-CpG-DNA 促进多糖特异性 IgG2a 水平的提高，理论上更能发挥疫苗的保护作用。

IgG2a 的类别转换是由 IFN-γ来实现的[15]，IgG2a 是Th1 类免疫反应代表的抗体分子，IgG2a 与巨噬细胞表面高亲和力的FcγRI 受体结合，参与巨噬细胞介导的宿主防御反应，巨噬细胞可以直接消除各种异物，杀伤细胞内的病原体。而IgG1 抗体主要介导吞噬细胞（如肥大细胞和噬酸性粒细胞）的防御作用。这说明BCG-CpG-DNA 作为佐剂具有诱导多糖疫苗导向Th1 类免疫反应的趋势，这在控制细菌感染方面有重要的意义。

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Immunoadjuvant activity of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine

ZHAO Ai-hua, LI Feng-xiang, JIA Shu-zhen, KOU Li-jie, QIAO Lai-yan, WANG Guo-zhi

Author Affiliation: Bacterial vaccine division, National Institute for the Control of Pharmaceutaical and Biological Products, Beijing 100050, China

To study adjuvantity of BCG-CpG-DNA from Mycobacterium bovis strain BCG to group A meningococcal polysaccharide antigen.

Mice were vaccinated s.c. with group A meningococcal polysaccharide vaccine alone and combined with different doses of BCG-CpG-DNA (5, 10, 100 µg), then the humoral response were assessed. antigen-specifec IgG and antigen-specifec IgG isotypes were tested by ELISA and analysis of antibody subclasses IgG1 and IgG2a levels.

BCG-CpG-DNA improved antibody level of antigen-specifec IgG and IgG2a, the middle and high dose (10, 100 µg) ofBCG-CpG-DNA group are statistically significant (< 0.05) vs vaccine controll group respectfly. It means that BCG-CpG-DNA induced Th1typeimmune responses.

BCG-CpG-DNA is a potential new immune adjuvant for group A meningococcal polysaccharide vaccine.

BCG-CpG-DNA; Immune adjuvant; Group A meningococcal polysaccharide vaccine

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@163.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.003

国家高技术研究发展计划（2006AA02A240）

王国治，Email：tbtestlab@163.net

2009-10-14