利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒

郝景波，吴云舟，刘艾林，尹杰超，任桂萍，李德山

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）属副黏病毒科副黏病毒亚科的禽副黏病毒属，根据其致病力的不同可分为低毒株、中毒株和速毒株。基因组为单股负链RNA，不分节段，大小为15～16 kb[1-2]。编码6种病毒结构蛋白，各基因的排列顺序为 3′-leader-NP-P-M-F-HN-L-trialer-5′[3-4]。

完全从cDNA克隆拯救不分节段的负链RNA病毒的方法是近几年建立的，这种方法能够对负链RNA病毒进行遗传操作，因此称为反向遗传学。该方法不仅能够研究病毒基因的功能，而且可以用病毒表达异种基因，也为生产改良疫苗及疫苗载体提供了一种新思路。狂犬病病毒是第一个完全由cDNA克隆拯救的负链RNA病毒，现在已经建立许多不分节段和分节段负链RNA病毒的反向遗传操作系统。1999年有两个独立的小组同时报道了第一个基于NDV弱毒疫苗株（LaSota）拯救系统[5-6]。适合拯救重组NDV中毒的系统是由Krishnamurthy等完成的[1]。

本试验成功拯救重组NDV Anhinga株，为病毒结构基因的研究、新型疫苗的研制和肿瘤治疗药物的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

BSRT7/5由Moss B博士惠赠，细胞培养于含10%胎牛血清，pH 7.4的DMEM液中。新城疫病毒Anhinga株的全长cDNA克隆的转录质粒pAnhwt、辅助质粒pTM1-N、pTM1-P和pTM1-L由美国东南禽病研究所Yu博士惠赠[7]。9日龄SPF鸡胚、SPF鸡血购于哈尔滨兽医研究所。

1.2 酶和生化试剂

DMEM培养基、优质胎牛血清（FBS）（购自GIBCO）；转染试剂Lipofectmine 2000（购自 Invitrogen公司）；G418（购自上海浩然生物技术有限公司）；胰蛋白酶（购自天象人生物工程有限公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）；质粒大提试剂盒（购自OMEGA公司）。

1.3 共转染

按照Fastfilter Endo-Free Plasmid Maxi Kit的说明书提取质粒 pAnh-wt、pTM1-N、pTM1-P和pTM1-L。BSRT7/5细胞用G418隔代筛选，培养至对数生长期经胰蛋白酶和EDTA联合消化后进行收集，接种于六孔板内生长至70%～80%单层，转录质粒pAnh-wt和辅助质粒pTM1-N，pTM1-P及pTM1-L分别以每孔 1、0.5、0.25和 0.1 μg，共转染BSRT7/5细胞，采用质脂体转染法，用Lipofectmine 2000转染试剂，按常规方法进行转染[8]。转染前，细胞单层用PBS洗一次，加入1 mL Opi-MEM培养基。500 μL转染反应物加入6 μL转染试剂，缓慢滴加入细胞单层上。转染6 h后弃去培养液，用含10%DMSO的PBS休克细胞2.5 min[8]，加入完全DMEM培养液，12 h换成无血清培养基Opi-MEM，并加入0.25%的胰蛋白酶（1 μg·mL-1）继续培养 2～3 d 后，细胞在-80 ℃冷冻，反复冻融3次，4℃4 000 r·min-1低速离心收集上清，取300 μL接种于9日龄SPF鸡胚。3～4 d后，收集尿囊液，按常规方法进行新城疫病毒的血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）。血凝阳性的尿囊液连续2次接种于9日龄SPF鸡胚扩增拯救病毒，拯救的病毒命名为rAnh-wt。

1.4 RT-PCR验证拯救病毒

获救NDV经鸡胚第三次传代，超速离心（37 000 r·min-1）后，应用Protein K法提取病毒RNA，用引物 1（ATTAGCGGAAAGTAACAGCAAGT）和引物 2（GAAGTCTGTTATTGGTGGTGCGGTG）RT-PCR扩增获救NDV的5 989～6 413 bp之间的片段，该片段包含通过定点突变引入的限制性内切酶KpnⅠ（6 363～6 368 bp）的识别位点，野生型的NDVAnhinga株没有KpnⅠ的识别位点。所扩增片段与pMD18-T simple载体相连，转化感受态DH5α扩增后提取质粒，并用KpnⅠ限制内切酶酶切鉴定正确后，测序以证明获救子代病毒是重组病毒。

1.5 测定病毒滴度

取9日龄SPF鸡胚，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞，DMEM培养基培养12 h，用0.25%胰酶消化后收集细胞，接种于六孔板，待细胞长成致密单层，用DMEM培养基将病毒液作连续10倍稀释（10-1～10-10），弃掉培养液，细胞用PBS洗2次，接种各稀释度的病毒液，做两个复孔，每孔1 mL，摇匀，使其布满细胞层，37℃吸附2 h，加首层琼脂（1%琼脂与含有8%CS的2倍DMEM 1∶1混合），每孔1 mL，室温下待琼脂凝固后，置于37℃，5%CO2培养箱中倒置培养48 h后，加入添加0.0025%中性红溶液的第二层琼脂（1%琼脂与含有10%CS的2倍DMEM 1∶1混合）2～3 d后开始观察空斑数目，按下列公式计算空斑形成单位：

空斑形成单位（pfu·mL-1）=（每孔平均空斑数×病毒稀释度）/每孔病毒接种量（mL）

2 结果与分析

2.1 cDNA的表达质粒和NP、P、L蛋白的表达质粒

将NDV Anhinga株整个基因组分为末端部分重叠的7个片段，利用相邻片段重叠部分存在的限制酶切位点连接成组装完整的NDV基因组cDNA；并利用NotⅠ/NarⅠ位点克隆在转录载体的T7启动子（T7 promoter）与丁肝病毒核酶（HDV Rz）之间，构建成病毒基因组转录质粒PAnh-wt。表达核蛋白（NP）、磷酸蛋白（P）及大聚合酶蛋白（L）基因的开放阅读框架（ORF）cDNA分别克隆在蛋白表达质粒pTM1的T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pTM1-NP，pTM1-P和 pTM1-L[7]。四种质粒PAnh-wt、pTM1-NP、pTM1-P和pTM1-L的结构如图1所示。

2.2 由克隆的cDNA拯救重组NDV

为了从cDNA克隆中拯救感染性 NDV，用NDV Anhinga株全长cDNA的转录质粒pAnh-wt和辅助质粒 pTM1-N、pTM1-P、 pTM1-L共转染BSRT7/5细胞。转染48 h后，细胞发生融合。72 h收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种9～11日龄SPF鸡胚，3～4 d后收获鸡胚尿囊液，经检测，血凝效价为32，血凝抑制滴度为256。血凝（HA）试验结果阳性的尿囊液，继续用鸡胚连续传代2次后，经检测，血凝效价为128，如图2所示。证明从cDNA克隆成功拯救感染性的NDV病毒。

2.3 鉴定子代病毒是重组病毒

扩增结果见图3，切酶鉴定见图4，所得质粒测序见图5。

图5 rAnh扩增片段测序结果Fig.5 Sequencing of rAnh amplified fragment

拯救的感染性NDV包含一个人工引入的限制性内切酶KpnⅠ的识别位点，作为鉴定重组病毒的分子标签。为了证明分子标签的存在，提取病毒RNA，用RT-PCR扩增含有人工引入的KpnⅠ识别位点的片段（5 989～6 413 bp），扩增结果如图3所示，得到425 bp的片段，证明已扩增出所要的序列。RT-PCR产物与pMD18-T simple载体连接后，提取质粒用KpnⅠ酶切鉴定，结果如图4所示，得到3 115 bp的片段，证明所扩增序列连入载体。所得质粒经测序，结果如图5所示，证明所扩增序列包含KpnⅠ的识别位点。

2.4 测定病毒滴度

利用双层琼脂法测定重组NDV的PFU，铺第二层琼脂后2 d观察蚀斑形成情况，利用公式计算拯救病毒的 PFU 为 2.3×108pfu·mL-1。

综上所述，本试验结果证明通过反向遗传操作技术，利用NDV Anhinga株基因组cDNA成功地拯救了具有感染性的重组子代病毒rAnhinga。

3 讨论

重组单股负链RNA病毒的拯救系统是基于RNP复合物的胞质内重构，它作为病毒聚合酶的模板，是病毒能够开始复制的先决条件。有研究表明，通过致病性测试，中毒株可以有效的研究哪些基因或氨基酸对病毒的致病性有影响，因此本研究选择中毒株Anhinga作为试验毒株[7]，采用完全质粒操作系统，将NDV Anhinga株基因组全长cDNA的转录质粒pAnh-wt和辅助质粒pTM1-N、pTM1-P和pTM1-L共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞。结果表明，利用这个系统成功从NDV全长基因组克隆拯救获得感染性的重组NDV病毒，经鸡胚传代3次后，得到较高滴度的重组病毒。本研究为实验室反向遗传技术平台的建立奠定了基础，为我们将来利用反向遗传技术对NDV基因组进行操作提供了技术保证。

新城疫病毒是危害养禽业的严重传染病，寻找安全有效的疫苗是目前迫切需要解决的问题[9]。利用反向遗传操作技术，在病毒基因组引入有限的突变，可以研究病毒与宿主之间的关系、NDV致病性的分子基础和单个蛋白的功能，这使得利用反向遗传操作技术研制新型疫苗成为近年来的研究热点。大量研究表明，NDV可以选择性地在禽类细胞中复制，而在大多数的哺乳动物正常细胞中不能复制，仅在肿瘤细胞中繁殖，对多种肿瘤均有杀伤作用，有望成为新型的治疗肿瘤的药物[10]。因此可以利用NDV反向遗传操作技术研制防治严重禽类疾病安全有效的疫苗，并为人类肿瘤治疗提供新的研究方向。

4 结论

本研究利用反向遗传技术成功拯救了NDV的中毒株Anhinga，建立了NDV的拯救技术平台，为将来重组NDV的应用奠定了基础。

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