西南地区鸭疫里默氏菌血清型调查和三价灭活油乳剂疫苗的研制

田 令 ，岳 华 ，2，汤 承 ，2

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省高等院校动物医学重点实验室，四川 成都 610041）

1 材料

1.1 菌株 2006年1月至2009年7月，从四川、重庆、云南规模化养鸭场中分离得到的261株鸭疫里默氏菌（RA），均为本室保存。

1.2 实验动物 1日龄健康樱桃谷鸭,购自成都某种禽公司；昆明系雄性小白鼠18～22g，购自川北医学院实验动物中心。

1.3 培养基和血清 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）购自杭州微生物试剂有限公司；LB培养基为本实验室配制；新生小牛血清购自成都哈里生物公司；血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型RA参考菌株由中国动物卫生与流行病学中心李明义教授惠赠。10号白油购自广州俏灵儿生物科技有限公司。

2 方法

2.1 血清型鉴定 采用玻片凝集试验对261株RA分离菌株进行血清型鉴定。

2.2 RA菌液浓度的测定 将RA接种于含5%小牛血清的LB肉汤中，置于37℃下振荡培养18h，用菌落平板计数法测定10倍系列稀释菌液的CFU，同时用紫外分光计测定对应浓度菌液的OD值，建立标准曲线。

2.3 疫苗株的筛选 挑选血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA分离菌株各5株，分别制备不同血清型的RA单价灭活油乳剂疫苗，疫苗中的抗原浓度为1.0×109CFU/mL。按下列程序免疫小鼠，每种疫苗免疫5只小鼠：首免，颈部和背部四点注射，每只0.2mL；分别间隔15d和10d后用相同剂量和方法进行二免和三免；三免后第9 d对各组小鼠断尾采血，分离血清，用玻片凝集试验检测血清RA凝集价，选择各血清型中凝集价最高的RA菌株为疫苗种子株。

2.4 RA三价灭活油乳剂疫苗的制备 分别将3个血清型RA种子株接种于含5%血清的LB肉汤中，37℃振荡培养18h，加入0.3%甲醛溶液后置于37℃振荡培养箱里灭活18h，按文献方法制备RA三价灭活油乳剂疫苗，疫苗中各型抗原含量均为1.6×109CFU/mL，同时进行质量检验。

2.5 安全性试验 将33只3日龄健康雏鸭随机平均分成3组，每组11只。第1组注射RA三价灭活油乳剂疫苗1mL，第2组注射三价灭活油乳剂疫苗2mL，第3组注射1mL无抗原佐剂乳化物作为免疫空白对照。

2.6 免疫效力测定 将288只3日龄健康雏鸭平均分成2组，每组 144只。第1组为免疫组，经颈部皮下接种0.5mL/只RA三价灭活油乳剂疫苗；第2组为空白对照组，经颈部皮下接种相同剂量的无抗原佐剂乳化物。各组于免疫后第6 d、14 d、21 d、28 d分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA攻毒。每组每个血清型分别攻毒12只，2×108CFU/只，连续观察7d，记录发病死亡情况。对死亡鸭进行剖检和细菌分离，存活鸭于观察结束时处死，同样进行病例剖检和细菌分离，以未出现病变和RA分离阴性为免疫保护。

3 结果

3.1 RA分离株的血清型 对261株RA血清型的鉴定结果显示，血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型RA分别占总分离株的39.85%、17.24%、11.11%、8.8%，未检出血清Ⅲ型菌株，未定型菌株占23.2%。

3.2 疫苗种子株的筛选结果 根据免疫后小鼠血清平板凝集价分别筛选出血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 型RA疫苗的种子株各1株，菌株编号为SWUN0269、SWUN1065、SWUN1093。

3.3 疫苗质检结果 RA三价灭活油乳剂疫苗离心15min无分层现象，滴于冷水表面不分散，为油包水状态，黏度试验显示流速为6.4s，菌检结果为阴性。

3.4 疫苗的安全性 2mL/只注射组的雏鸭仅在12h内精神稍差，食欲有所下降，之后恢复正常；1mL/只注射组和1mL/只空白对照组的鸭只未见异常。

3.5 疫苗免疫效力 三价灭活油乳剂疫苗首免后各组鸭只的攻毒保护情况见表1。

表1 RA三价灭活油乳剂疫苗免疫后不同时间的攻毒保护结果

从表1可见，免疫后6 d攻毒，免疫组和空白对照组之间保护数无显著差异，说明此时疫苗尚未产生有效免疫保护；至免疫后第14 d，免疫组的攻毒保护率显著高于空白对照组，对3个血清型的攻毒保护率均在83.33%～100%，并持续至28 d未见下降。

4 讨论

本研究结果显示西南地区至少存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4个不同的血清型，说明西南地区鸭群中鸭疫里默氏菌病的病原复杂多样，血清Ⅰ、Ⅱ型为优势血清型，与国内其他地区情况类似。值得注意的是，2003年四川、重庆、云南等省市的血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA菌株占总分离株的52.06%，而我们的研究结果显示2006～2009年这些地区Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分离株占总分离株的68.20%，分离率有显著增高的趋势，这也是本研究选择研究三价灭活疫苗的重要依据。

此次我们的研究结果显示，在3日龄免疫后14d分别用同型RA攻毒，其保护力均达到83.33%以上，有的血清型的保护率高达91.67%，与文献比较有的血清型攻毒保护力稍低，这可能与攻毒浓度及不同血清型RA毒力差异和对雏鸭免疫的日龄有关。从后两次攻毒保护试验来看，最高保护力也可达到100%，且持续至28d保护力未下降，说明该三价灭活油乳剂疫苗在对雏鸭进行一次免疫后就具有很好的保护力，且持续期长，足以保护雏鸭至上市日龄。

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