旧院黑鸡致病性大肠杆菌的分离与药敏试验

何 博

（四川省达州职业技术学院经济管理系，四川 达州 635001）

2009年10月初，我校附近一小型养鸡户养殖的旧院黑鸡发病，并有死亡。通过临床症状，病理剖检初步诊断为旧院黑鸡大肠杆菌病。从现场采集了病料，通过病原分离、生化培养等试验，最终确定病原体为禽致病性大肠杆菌。分离的大肠杆菌用临床常用抗生素进行了药敏试验，根据药敏结果合理选择药物，有效地控制了该鸡场的病情。现报道如下：

1 材料

1.1 病料来源 无菌采集自发病养殖场患病死亡的旧院黑鸡的肝脏和心血。

1.2 主要试剂及培养基 培养基：营养琼脂平板、营养琼脂斜面、麦康凯琼脂平板、三糖铁琼脂斜面等，所有培养基均按照文献[1]自行配制；细菌生化鉴定管：肠杆菌科细菌生化常规微量鉴定管（11种×15支/盒），杭州天和微生物试剂有限公司生产；试剂：细菌生化微量试验试剂盒（10mL×10种），杭州天和微生物试剂有限公司生产；革兰氏染液、麦氏标准比浊管等自行准备。

1.3 药敏纸片 氨苄西林、氨苄西林/克拉维酸、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、环丙沙星、诺氟沙星、四环素等11种药敏纸片由杭州天和微生物试剂有限公司生产；氟苯尼考药敏纸片按文献[2]自行制作。

1.4 主要试验设备 恒温培养箱、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、分光光度计、pH计、电炉、冰箱等。

1.5 试验动物 健康小白鼠10只，体重18～22g/只。

2 方法

2.1 细菌的分离培养 无菌采集病死鸡的肝脏、心血，划线接种于营养琼脂平板上，37℃培养18～24h，然后挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养18～24h，再选取平板中单个典型菌落接种于营养琼脂斜面上，37℃培养18～24h，4℃保存备用。

2.2 细菌的染色镜检 用灭菌接种环挑取营养琼脂斜面上的菌落制成涂片，革兰氏染色后镜检。

2.3 生化试验 挑取营养琼脂斜面上的菌落接种到三糖铁培养基上，37℃培养18～24h，观察细菌在培养基上的生长特征。参照生化鉴定管使用说明书，挑取营养琼脂斜面上的单个菌落接种于肠杆菌科细菌生化常规微量鉴定管内，37℃培养，按规定时间对菌株的生化反应结果进行判断。

2.4 动物试验 取细菌的营养琼脂斜面培养物，用灭菌生理盐水无菌洗下制成细菌悬液，将菌悬液的浓度用生理盐水调至0.5麦氏单位（细菌数约为1.5×108CFU/mL）待用。将10只小白鼠随机平均分成2组，每组5只，第1组每只小白鼠腹腔注射菌悬液0.2mL；第2组腹腔注射无菌生理盐水0.2mL作对照。隔离饲养，观察小白鼠的发病死亡情况。小白鼠死亡后剖检，将病变组织接种于麦康凯培养基上，挑取可疑菌落镜检、生化鉴定。

2.5 药敏试验 按“纸片法抗菌药物敏感试验标准”进行药敏试验。用一无菌棉拭子蘸取校正为0.5麦氏单位的菌悬液，在管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液，均匀涂布于整个琼脂平板表面。等平板上的菌液稍干后，将药敏片依次均匀贴放到平板上。各纸片中心相距约24mm，纸片距平板边缘约15mm，各纸片间距离相等。将平板倒置于37℃温箱中培养16～18h，然后观察结果。

3 结果

3.1 细菌的培养特性 经37℃培养18～24 h后，该病料菌株在营养培养基上生长良好，形成一种圆形凸突、光滑、湿润、边缘整齐、半透明、中等大小的灰白色菌落；在麦康凯琼脂培养基上形成直径1～2mm左右、光滑湿润的红色菌落；在三糖铁琼脂斜面中，斜面变黄，管底变黄、产气，无H2S产生。

3.2 染色镜检结果 细菌涂片经革兰氏染色后镜检，可见：阴性小杆菌，两端钝圆，散在或成对存在。

3.3 生化试验结果 分离菌株的生化试验结果见表1。分离菌株的生化特性完全符合大肠杆菌的特征。综合培养特征、镜检特征、生化试验结果，可鉴定此分离菌株为大肠杆菌。

表1 分离菌株的生化试验结果

3.4 动物试验结果 小白鼠在细菌接种后24～48h内全部死亡。剖检死亡小白鼠，发现肝脏肿胀出血，心外膜出血，从死亡小白鼠的肝脏和心血中，分离得到与原分离菌株一致的革兰氏阴性杆菌。对照组无异常表现。这说明分离菌株为致病性大肠杆菌。

3.5 药敏试验结果 将分离的菌株与氨苄西林、环丙沙星等12种常用抗菌药进行药敏试验，结果表明菌株对其中的3种敏感，3种中敏，6种耐药。结果见表2。

表2 药敏试验判断标准及结果

4 小结与讨论

4.1 根据分离菌株的培养特性、染色特性、生化试验及动物试验结果，鉴定分离菌为致病性大肠杆菌。鸡的大肠杆菌病是由大肠杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称，本病一年四季均可发生，各个品种和日龄的鸡均可发病，但雏鸡最易感，雏鸡发病率可达30%～60%，病死率可达100%。

4.2 大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，由于近年来抗菌药物使用频率和使用量的增加，导致大肠杆菌耐药株和耐药能力都不断增加。本次药敏试验结果也表明，曾对大肠杆菌敏感的广谱青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类抗菌药随着临床的广泛应用而产生了不同程度的耐药。

根据药敏试验结果，选择高敏药物——氟苯尼考的可溶性粉剂对全场鸡混饮（100mg/L）给药，每天2次，每次2h，连续使用4d，同时加强对饲喂用具及鸡舍环境的卫生消毒，可以有效地控制鸡只死亡，使鸡群逐步恢复健康。

4.3 大肠杆菌是一种普遍存在的肠道常在菌群，防治本病的关键是：加强饲养管理、消除各种应激因素，增强鸡只的抵抗力；加强环境卫生管理，做好各个养殖环节的卫生消毒，控制大肠杆菌的大量繁殖。

4.4 为了有效防治大肠杆菌病，也为了减少畜产品中抗菌药物的残留，在临床用药时应注意：避免采用抗菌药低剂量长期预防用药，可选用无毒性、无残留的微生态制剂或有效的大肠杆菌疫苗进行日常预防；为了增加治疗的针对性，最好使用经药敏试验筛选的敏感性药物进行治疗，病愈后应及时停药；加大开发有效的灭活酶抑制剂、外输泵抑制剂、耐药质粒消除剂、抗菌药物增强剂等，和抗菌药物联合使用，提高药物的敏感性，降低使用剂量；加强开发对大肠杆菌有抑制作用的中草药制剂，发挥其低毒性、无残留、不产生耐药的优点。

[1]甘肃农业大学主编.兽医微生物学试验指导[M].北京：中国农业出版社，1991.

[2]周喜翠.简易药敏纸片的制作和应用 [J].北方牧业，2005，23：27.

[3]中华人民共和国卫生部.纸片法抗菌药物敏感试验标准[S].WS/T 125-1999.

[4]甘肃农业大学主编.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，1994：212-217.

[5]蔡宝祥.家畜传染病学（第4版）[M].北京：中国农业出版社，2006：47.

[6]常维山，王应文，孙金华，等.我国部分地区鸡源大肠杆菌耐药性分析[J].山东畜牧兽医，2009，30：44-46.

[7]史同瑞，周建丽，许腊梅，等.应用微生态制剂防治鸡大肠杆菌病试验[J].畜禽业，2008，（8）：36-37.