小鹅瘟病毒的分离鉴定与临床病变观察

何经纬，刘 晶，汤文杰

（1.四川省畜禽繁育改良总站，四川 成都 610041；2.四川省南充市高坪区马家小学，四川 南充 637100；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125）

本研究采集患病雏鹅样本通过鹅胚分离病毒进行病原学研究与血清学检测，再以感染鹅胚尿囊液人工接种8日龄健康雏鹅，观察在临床上的主要病理变化特征。现将结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料 试验动物：50只1日龄健康的四川白雏鹅，购自雅安非小鹅瘟疫区，12～15孵化日龄非免疫鹅胚30枚；小鹅瘟病毒毒株:由四川农业大学禽病防治研究中心分离自四川省乐山市10日龄患小鹅瘟死亡的四川白雏鹅；小鹅瘟标准阳性血清（本实验室保存）。1mL无菌注射器10支（12号针头，5mm）、碘酒、酒精棉球、手术剪、纱布、研钵、冰箱、离心机、毛细管、超净工作台、高压灭菌器、孵化器、照卵器、记号笔、试管（10支）、青霉素空瓶（20个），青链霉素（各100万单位）、氯化钠、琼脂，饲料7.5kg，相关养鹅器具。

1.2 方法

1.2.1 病样采集及处理 用无菌方法取患病雏鹅的肝脏、脑、肠等器官病料置灭菌的玻璃器皿中冷冻保存，作为病毒的分离材料。先将病料剪碎、磨细，用灭菌PBS液作1∶5倍稀释，反复冻融3次，经3000 r/min离心30min，取上清液添加青链霉素（终浓度为10000单位/mL），经细菌学检验为阴性者置于4℃冰箱中保存为接种材料。

1.2.2 病毒返强试验 饲养1日龄雏鹅10只，肌肉注射尿囊毒液每只0.2～0.5mL。选择10日内有典型临床症状的死亡雏鹅，取其肝、脑于研钵内，剪碎、研磨，用生理盐水（含双抗1万单位/mL）制成5倍乳剂，经5 000 r/min离心10min，反复冻融数次，取上清置于4℃冰箱中过夜（反复几次，直到死亡率达60%～80%）。

1.2.3 鹅胚接种 用上述接种材料接种12～15孵化日龄非免疫鹅胚30枚。参看文献进行尿囊腔接种，每枚胚尿囊腔注射0.2～0.5mL。38℃继续孵化5～8d，24h内死亡者弃去。每隔8h照蛋观察一次，收集24～120h死亡的胚置于4℃冰箱内，冷却收缩血管，12h后无菌收集尿囊液，添加青链霉素（终浓度10000单位/mL），静置作用2h，冻存。注意观察鹅胚头、四肢病理解剖变化。

1.2.4 琼脂扩散试验 被检测抗原制备：取患病雏鹅的肝脏、脑、肠等器官病料置灭菌的玻璃器皿中剪碎、磨细，用无菌生理盐水作1∶2～1∶3倍稀释，4℃冰箱中冻融2次。经3000 r/min离心30min，取上清液加入等量的氯仿，振摇30min。经3 000 r/min离心30min，取上清液冻融1次，再经3 000 r/min离心30min，取上清液加入等量的氯仿，振摇30min。又经3 000 r/min离心30min，舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01M的PBS（pH 7.2）适量悬浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛灭活后，即为小鹅瘟病毒沉淀抗原。

琼脂平板制备：在1 000mL生理盐水中加入优质琼脂1g，加热使其完全溶解后，调整pH值至7.8浇铸成3mm厚的平板，待冷却后打孔。中央1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm，并用熔化琼脂封底。

检测方法：用已知诊断抗血清来检测制备的抗原，中央孔加入诊断抗血清，周围孔加入 1∶4、1∶6、1∶8 倍稀释的被检测抗原，并设置一组重复。将加样后的琼脂平板置于湿盒中，37℃恒温培养，每隔12 h观察1次，至48 h结束，记录结果。

1.2.5 雏鹅人工感染试验 攻毒前，先将50只1日龄四川白雏鹅（其中20只为试验组，10只为同居组，20只为对照组）。饲养在未被小鹅瘟病毒污染的环境中，观察7d以确保其为健康雏鹅。7d后试验组进行滴鼻接种感染鹅胚尿囊液（1mL/只），同居组、对照组不作任何处理。在此后的 10min、30min、60min、90min、4h、12h、48h、72h、9d、15d 解剖试验组、同居组、对照组小鹅各2只，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、哈德氏腺、法氏囊、食管、气管、肠等部位观察剖检变化。

2 结果与分析

2.1 鹅胚接种结果 将采集后处理过的病料接种于30只鹅胚，24h内未见死亡的鹅胚，鹅胚在2～7 d死亡的有25只，计算该病毒对鹅胚的致死率为84%。无菌条件下收集尿囊液，每枚约收集尿囊液4～6mL。观察鹅胚病变：尿囊液透明清亮；绒毛尿囊膜有出血点；胚体充血、出血。

2.2 病毒返强试验结果 第1次病毒返强时，10日内10只雏鹅死亡8只，死亡率为80%，已达到病毒返强目的，故共只有1次病毒返强试验。雏鹅死亡时间分布见表1。

表1 小鹅瘟病毒返强时雏鹅死亡时间分布

2.3 琼扩结果 在中央孔加入诊断抗血清，周围1、2、3 孔内分别加入 1∶4、1∶6、1∶8 倍稀释的被检测抗原，1′、2′、3′为一组重复。该抗原在琼脂扩散试验中能够与小鹅瘟阳性血清出现沉淀线，属于阳性反应，且与小鹅瘟标准抗原形成的沉淀线相吻合。见图1。

图1

2.4 滴鼻攻毒组临床症状 从第8 d开始有攻毒鹅因小鹅瘟病毒致死，从第10 d开始有同居鹅因小鹅瘟致死。死前症状：两腿呈划水状，喙端、爪尖发绀。继续观察各组的临床表现，攻毒组、同居组都表现为精神萎顿，食欲减退，不愿活动，出现严重下痢，排灰白色或青绿色稀粪，粪中带有纤维碎片或未消化的饲料等，临死前头触地，两腿抽搐。对照组的雏鹅生长情况良好。

2.5 雏鹅人工感染试验剖检结果 滴鼻组解剖变化：肝脏有出血点或淤血，胆囊充盈，心脏部分部位有点状出血，十二指肠弥漫性出血，肠壁变薄，盲肠有香肠样栓塞，泄殖腔潴留少量黄白色液体，脑膜充血、出血。这与相关资料报道的相一致。同居组解剖变化：肝脏有出血点，胆囊充盈，脾脏肿大，心脏部分部位有点状出血，十二指肠弥漫性出血，盲肠有香肠样栓塞，泄殖腔有出血且潴留少量黄白色液体，脑膜充血。

同居组死鹅几乎与攻毒组死鹅有同样的临床表现和解剖变化，差别只是攻毒组的发病时间比同居组的早。

3 讨论

3.1 小鹅瘟病毒感染小鹅后主要表现为体液免疫反应，首先出现IgM，然后是IgG，康复的雏鹅以及经过隐性感染的成年鹅均能产生高水平的病毒中和抗体和沉淀抗体，并持续很长时间，还能将抗体通过卵黄传给后代，使孵出的雏鹅免于发病。以小鹅瘟病毒抗原反复免疫兔、牛、羊、猪等动物，也能产生高水平的病毒中和抗体和沉淀抗体，并可用于小鹅瘟病毒感染的预防和治疗。将小鹅瘟病毒通过非免疫鹅胚传代增殖，取感染胚尿囊液制备小鹅瘟病毒沉淀抗原，该抗原在琼脂扩散试验中能够与小鹅瘟阳性血清出现沉淀线。本试验结果表明，本次制备的小鹅瘟病毒沉淀抗原可以用于小鹅瘟临床免疫效果监测和流行病学调查，对其研究、诊断和防治具有实用价值。

3.2 关于小鹅瘟病毒沉淀抗原的制备，国内资料报道了4种方法：王永坤等将感染的尿囊液装入透析袋硅胶浓缩；郝虹等采用0.40 kg/L饱和度的硫酸铵盐析处理；王新海通过差速离心法提取抗原；程由铨等使用聚乙二醇（PEG）沉淀病毒。按照病毒学理论，病毒一般在0.45 kg/L以上饱和度的硫酸铵盐析中发生沉淀，0.40 kg/L的饱和度不可取。差速离心法需要使用40000 r/min的转速，这不是普通实验室的离心设备所能达到的，而且在实际应用中也不易操作。本次试验采用反复离心加氯仿抽提的方法成功地制备了小鹅瘟病毒沉淀抗原，是一种快速、有效的制备方法，具有广泛的应用价值。

3.3 琼脂扩散试验是根据可溶性抗原与可溶性抗体在含有电解质的琼脂网状基质中向四周自由扩散，由近向远形成浓度梯度的原理而进行的。当抗原与抗体在琼脂基质中适合比例下相遇，便可相互结合，产生抗原抗体复合物，出现肉眼可见的沉淀线。影响琼脂扩散试验的因素有：（1）反应物的浓度。两反应物浓度越高，所形成的沉淀线越清晰。（2）反应的温度。在一定的范围内（如0～37℃）温度越高，物质扩散速度越快，沉淀线形成越快。为减少沉淀线的变化，并保持清晰度，可在37℃形成沉淀线后置温室或冰箱中。（3）反应时间。沉淀线一般1～3d出现，14～21d数目最多，只有在适当的时间内，才可以见到清晰的线条，时间太长则可能出现沉淀线的分裂、溶解、扩散甚至消失。此外沉淀线的形成还与反应物的性质、琼脂的浓度、抗原抗体孔间距离等有关。

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