马铃薯遗传多样性的ISSR分析

田大翠，朱宏波，郭建夫，黄建堂

（广东海洋大学农学院，广东 湛江 524088）

马铃薯是世界第4大粮食作物，也是我国重要的粮食及大宗蔬菜作物，随着世界人口的急剧增加、耕地面积的减少、大宗粮食作物种植效益的不断下降以及水资源短缺和膳食结构的改善，马铃薯的重要性和马铃薯育种的紧迫性也日益显现。马铃薯属同源四倍体作物，以无性繁殖为主,遗传复杂[1]。马铃薯育种目前仍以品种间杂交育种和芽变育种为主[2]。对马铃薯种质资源的正确评价是育种的关键。

中国马铃薯种质资源的研究还很落后，且主要应用的手段是形态比较、细胞学观察等[1]，而分子水平的鉴定研究工作进行的较少。邸宏等[3]利用RAPD和AFLP标记分析了中国主要马铃薯的遗传多样性，认为中国马铃薯主栽品种从遗传组成上差异小，遗传多样性差，亲本来源单一,遗传基础较为狭窄。李凤云等[4]利用RAPD和AFLP分子标记技术对19份克新系列马铃薯品种进行遗传分析，认为克新系列马铃薯品种遗传基础有所拓宽。何凤发等[5]利用SRAP分子标记对44份马铃薯的遗传多样性进行了分析，将所选品种在血统上分为了四大类群。姚国胜等[6]利用SSR分子标记对来自河北和黑龙江两个省份的58个马铃薯晚疫病菌株基因组DNA进行SSR基因型鉴定，分别将两省的菌株分为4个和2个SSR基因型。利用分子标记手段对种质资源进行准确、科学的鉴定和评价，明晰材料的遗传基础，可为育种工作提供分子依据，对马铃薯种质资源的收集、保存和利用都具有重要的意义。

本研究利用ISSR分子标记技术，对中国各地马铃薯品种和部分国外品种进行遗传多样性分析，从分子水平分析中国各地马铃薯品种间遗传关系及遗传基础，为马铃薯品种的进一步开发和利用以及种质鉴定提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料品种和来源见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA制备

采用SDS法提取马铃薯基因组DNA[7]。

1.2.2 PCR反应与电泳

引物和dNTPs由上海生工合成，Taq DNA聚合酶为实验室自产。采用20 μL的反应体系进行PCR扩增,反应体系：Taq 酶 0.3 μL（1U），2 μL 的10 ×PCR Buffer（含Mg2+），模板DNA 1 μL(1 ug)，10 mM dNTP 0.15 μL，引物 1 μL，加水补齐至 20 μL。扩增参数为：94℃预变性5 min，然后进行40个循环：94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，最后72℃延伸5 min，20℃终止反应。PCR产物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离、银染、读带。

1.2.3 数据分析

电泳结果的每条DNA谱带为1个单位，同一ISSR位点上有带的赋值为1，无带的赋值为0，统计结果以1、0矩阵输入计算机，建立数据库，用NTSYS-ps软件处理数据，并对材料进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

从60条ISSR引物中筛选出10条能够在马铃薯基因组DNA中扩增出清晰条带的引物（表2）。10条引物共计扩增出57条DNA条带，其中多态性条带48条，多态率为84.21%，不同引物扩增的多态比率分布在50%～100%，引物的PIC值平均为0.2055。每个引物扩增的DNA条带数在2～13之间，平均5.7条。扩增条带数最多的引物为UBC 850，达13条，扩增条带数最少的引物为UBC 807和UBC 812，扩增条带为2条（图1）。

表1 试验材料来源与编号Table1 The origin and code number of materials

表2 ISSR分析所用引物序列和扩增结果Table2 The primers alignment and amplified results of ISSR analysis

图1 引物UBC 850在不同马铃薯材料中的ISSR图谱Figure1 Electrophoresis diagram of different potatoes by ISSR primer UBC850

图2 20份马铃薯材料基于ISSR分析的UPGMA聚类图Figure2 Dendrogram of 20 potatoes varieties based on ISSR markers

2.2 聚类分析

聚类分析结果如表3，20份马铃薯材料的遗传相似系数在0.5263～0.9825之间，平均相似系数为0.7220，其中克新13号和克新21号之间遗传相似系数最大，为0.9825，其次是241和克新13号，为0.9474，说明它们的亲缘关系非常近。遗传相似系数最小的是克新20号和富金，为0.5263，其次是富金和DD419，为0.5439。富金和中薯1号，黑美人和YN-1，中薯1号和克新16号之间也比较小，为 0.5965，表明它们之间遗传差异较大。总体上来说，所选择的马铃薯材料间的亲源关系比较远，反映出中国马铃薯品种的遗传关系比较远，在育种上可以利用的空间比较大。

通过聚类分析可知（图2），在相似系数为0.73附近，20份马铃薯材料分为五大类，富金单独是一类，第二类有2个品种，即克新17号和黑美人，大西洋和YN-1为第三大类，克新20号和中薯1号为第四类，其余归到第五大类。第五大类又可以分为三个亚类。抗青9-1与来自荷兰的品种费乌瑞它亲缘关系较近，克新系列相对较集中，且多和Mira、Epoka有亲缘关系，但克新17号和黑美人有血缘关系，克新20号有了Fortuna的血缘，说明克新系列也在不断的拓展其亲本来源。而作为富金的父本，尤金并没有和富金聚在一起，这可能是因为其多倍体的特点使得尤金在作父本时所产生的配子具有了遗传差异。

3 讨论

3.1 ISSR分子标记用于马铃薯遗传多样性的分析

ISSR标记作为以PCR为基础的分子标记，除了具有操作简单的优点外，还具有稳定和多态条带丰富的优点，近年来在遗传多样性分析领域被广泛应用[8-11]。本试验利用10条ISSR引物将20份马铃薯材料完全区分开来，试验结果与前人基本一致，说明ISSR分子标记适用于马铃薯种质资源遗传多样性的分析。另外，我们在读带的时候只读取了完全清晰可辨的条带，虽然这在一定程度上会降低条带的丰富性，但却保证了结果的准确性。

3.2 国内马铃薯品种的遗传多样性研究

已有研究表明，我国马铃薯主栽品种整体上遗传基础较为狭窄，遗传组成上差异小，遗传多样性差，且存在地域差异小的特点，不同地方品种间的交流比较小。本研究表明，我国既有品种中有许多和现在的主栽品种之间遗传差异还是很大，马铃薯育种工作中应该加强对这些品种和一些野生资源的利用，尽量拓宽亲本的来源[12-13]。随着马铃薯育种研究的不断发展，地方品种间的交流将更加密切，野生种和来自国外的优良品种在中国马铃薯育种中将发挥巨大作用。

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