马铃薯青枯病菌生化型研究及菌株接种方法的比较

王晓丹，闵凡祥，郭 梅，胡林双，魏 琪，董学志，李学湛

（黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

马铃薯青枯病是由Ralstonia Solanacearum(RS)引起的一种世界性的重要细菌性病害，每年因此造成的产量损失大约为10%～15%，发病严重的地块产量损失可达80%甚至绝产，给马铃薯生产带来严重威胁。由于青枯病为细菌性病害，植株感病是系统性侵染，青枯病的药剂防治十分困难。目前，防治青枯病最根本有效的方法是采用抗病品种，但是，马铃薯品种的抗病性对于不同的青枯菌系是有差异的[1]。因此鉴定和研究马铃薯青枯病菌生化型的组成和分布，将为加速我国马铃薯抗青枯病育种和病害综合防治的工作进程提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试的10个菌株分别来自我国山东、广东和广西3省。菌株全部从送检至我单位的马铃薯青枯病样品中分离纯化获得。菌株来源情况见表1。用于分离纯化的培养基为2，3，5-氯化三苯基四氮唑干酪素选择性培养基（简称TZC）、用于纯培养的培养基是基础培养基（简称Kelman）[2]。

表1 供试菌株Table1 The tested strains

1.2 生化型鉴定

休和利夫森二氏培养基[3]：蛋白胨2 g、NaCl 5 g、K2HPO40.2 g、葡萄糖10.0 g、琼脂6.0 g、1%溴百里酚蓝溶液3 mL、蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，分装于试管中，115℃蒸汽灭菌20 min。灭菌后，分装试管，高度约为4.5 cm。配置10%浓度的纤维二糖、乳糖、麦芽糖、己六醇、甘露醇和山梨醇溶液，分别过滤灭菌，加入凉至60℃的休和利夫森二氏培养基中，终浓度为1%。

以18～24 h幼龄菌种作种子，穿刺接种至休和利夫森二氏培养基中，每株 3支。同时以不接种的 3管培养基作为阴性对照。30℃培养 1、2、3、7、14 d后，观察结果。

1.3 生化型鉴定标准

若接种培养基产酸由橄榄绿变为黄色并且阴性对照不变色的判断为阳性。生化型鉴定参照1964年Hayward[4]的划分标准进行，见表2。

1.4 青枯菌接种方法

以番茄作为接种植物，采用伤根灌注法和刺茎法2种方法进行人工接种，并设清水对照，重复3次，筛选最佳接种方法。

（1）伤根灌注法：在温室进行营养穴盘育苗，在5～6片叶时期，在幼苗的一侧，距根1 cm处用刀造成伤口，每株番茄苗在伤根部位灌注50 mL菌液（菌液浓度大约为1×109 cfu·mL-1）。将接种后的番茄苗放入人工气候箱内，设定温度30℃，光照16 h，黑暗8 h，空气湿度保持在80%以上，定期浇水，保持土壤湿润。若湿度无法达到，则可以用一个塑料袋包住植株，植株顶部将塑料袋开一小口，以保持其湿度，促进发病。在接种后7、14、21 d观察发病情况。

表2 根据对双糖的利用和己醇的氧化产生酸时为阳性（+）对青枯菌分类Table2 Classification of Ralstonia solanacearum based on the ability to utilize disaccharides and oxidize hexose alcohols producing acid when it is positive(+)

（2）刺茎法：将灭好菌的牙签挑取青枯菌菌液若干，直接插到第3节叶腋处，每1株插1根，插牙签时要注意不用插得太深，以免植株在未发病前就萎蔫死亡。放入人工气候箱培养，培养条件同上。

在接种后7、14、21、28 d，按Winstead等[5]分级标准进行分级调查，共分5级，分级标准为：0级：不发病；l级：1片叶感病；2级：2或3片叶感病；3级：除了顶端2～3片叶其余叶片均感病；4级：所有叶片感病；5级：植株完全死亡。

2 结果与分析

2.1 生化型测定

对来源于我国3个省份的从马铃薯寄主上分离的10个青枯病菌的生化型鉴定，结果见表3，测定结果可以看出：生化型Ⅱ和Ⅲ为优势种群，均占被测菌株的40%，生化型Ⅰ和生化型Ⅳ分别占10%。从地域上来看，被检样品中，我国山东省马铃薯青枯病菌生化型有3种，分别为生化型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ；广东省马铃薯青枯病菌生化型有2种，分别为生化型Ⅱ和Ⅲ；由于广西省被检样品数量有限，发现1种生化型，为生化型Ⅰ。

2.2 病原菌接种

试验结果表明，利用伤根灌注法接种马铃薯青枯病菌的效果好于刺茎法。前者接种的番茄苗14 d内均发病，发病较后者快；伤根灌注法接种的番茄苗发病级数都为4级，而刺茎法发病级数为2～3级。从操作难易程度来看，伤根灌注法比较简单，而刺茎法操作时要掌握好力度，容易伤及幼苗。因此，综合分析，马铃薯青枯病接种方法以伤根灌注法较好。

表3 被测菌株生化型测定结果Table3 The classification results of tested strains

3 讨论

青枯病菌生化型在我国不同地区和不同植物上的分布状况是相当复杂的，据国外资料记载在马铃薯上4种生化型都有存在[2]。本研究的被测马铃薯青枯病菌菌株包含了上述全部4种生化型。1985年，华静月等[1]对我国8个省市的43个青枯菌菌株测定生化型，结果表明，供试的绝大部分菌株属生化型Ⅱ，少数属于生化型Ⅲ和Ⅳ。本研究中的优势种群为生化型Ⅱ和Ⅲ。从地域上看，本研究的被测广东省菌株中，生化型Ⅲ为优势种群，占60%。曾宪铭等[6]测定广东农作物青枯病菌生化型的结果是其所测青枯病菌在马铃薯寄主上的生化型为Ⅱ、Ⅳ和Ⅲ-2。本研究中山东省马铃薯青枯病菌以生化型Ⅲ为优势种群，占50%，与丁爱云等[7]报道的山东省马铃薯青枯病菌以生化型Ⅲ为主的结果一致。

1976年Harris[8]认为，可以把Hayward模式中的生化型进一步划分为亚型，自1984年华静月等[9]研究报道了我国青枯病菌有生化亚型的存在，之后又有曾宪铭等[6]、丁爱云等[7]、徐莉莉等[10]报道了我国青枯病菌生化亚型的存在。在本研究中没有测定到被测菌株中有生化亚型。

由于本研究的菌株数量有限，特别是广西省收集到的菌株数量很少，因此本研究的结果尚不能代表上述3省份的所有马铃薯青枯病菌的生化型种类及优势种群，有待于今后加大菌株的收集量，做更详细地研究。

[1]华静月,张长龄,何礼远.我国马铃薯青枯菌菌系和初步研究[J].植物病理学报,1985,15(3):181-184.

[2]French E R,Gutarra L,Aley P,et al.Culture media for Pseudomonas solanacearum:Isolation,identification and maintenance[J].Fitopatologia,1995,30:126-130.

[3]东秀株,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[4]Hayward A C.Characteristic of Pseudomonas solanacearum[J].Appl Bact,1964,27(2):265-277.

[5]Winstead N,Kelman A.Inoculation technique for evaluating resistance to Psedomonas solanacearum[J].Phytopathology,1952,42:628-634.

[6]曾宪铭,董春.广东农作物青枯病菌的生化型[J].华南农业大学学报,1995,16(1):50-53.

[7]丁爱云,郑继发,时呈奎,等.山东省植物青枯菌生化型研究[J].山东农业大学学报,2002,33(1):50-52.

[8]Harris D C.Bacterial wilt in Kenya with particular reference to potatoes[M]//Sequeira L,Kelman A.Proceedings of the first international planning conference and workshop on the ecology and control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum.North Carolina State University,Raleigh,1976:84-88.

[9]华静月,张长龄,何礼远.我国植物青枯菌的生化型和其他生理差异[J].植物保护学报,1984,11(1):43-50.

[10]徐莉莉,尹燕妮,王勇明,等.发生于中国的青枯病菌生化变种研究[J].江苏农业科学,2008(5):102-10.