粉防己碱与抗肿瘤药物相互作用对HNE-1细胞周期的影响

王洪鹏 叶 琳 王 驰 陈鸿雁"

粉防碱（TET）是防己科植物粉防己 （Stephania tetrandra S.Moore）的主要活性成分。资料表明粉防己碱具有多种生物学效应，在肿瘤防治等方面具有很好的应用前景。研究表明，粉防己碱能明显增强柔红霉素（DNR）和长春新碱（VCR）杀伤白血病细胞的能力[1]。但是粉防己碱对鼻咽癌耐药细胞株作用报道较少。化疗药物导致细胞周期发生变化，细胞增殖受到抑制，最终诱发细胞调亡从而杀伤肿瘤细胞，这是化疗药物的常见机制之一[2]。有关抗肿瘤药物对细胞周期的影响报道较多，但药物相互作用引起耐药细胞和非耐药细胞细胞周期变化的文献报道较少。本研究以鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象，采用流式细胞仪分别检测天然药物TET和VRP分别与4种常用抗肿瘤药物联合应用对两细胞株细胞周期的影响，并进行比较，为进一步探讨TET的临床药理作用提供基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）细胞系和照射、培养条件：人鼻咽癌（HNE-1）细胞株，由重庆医科大学医学超生工程研究所惠赠。（2）试剂：RPMI-1640培养基（GIBlo，USA.），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），盐酸维拉帕米注射液（VCR，购自上海禾丰制药有限公司）；TET（标准品，浓度98%，购自浙江金华制药厂），二甲基亚砜 （DMSO，分析纯，苏州工业园区正兴化工研究院），四甲基偶氮唑盐（MTT，北方同正生物制品公司）。（3）仪器：二氧化碳孵箱 （美国LRBODEL），超净工作台 （苏州净化设备厂），倒置显微镜 （重庆光学仪器厂，XSZ-D2型），Varian 600C型直线加速器（美国）；光学显微镜（Olympus）；超低温冰箱（-86℃，Nuaire，美国）；Mikro 22R 低温高速离心机（Hettich，德国）；台式离心机（LD4-2，北京医用离心机厂）；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱 （上海跃进医疗器械厂）；流式细胞仪FACSCalibar（BECTONDICKINSON，美国）。

1.2 方法 （1）分组：1组为VCR+TET，VCR+VRP；2组为BLM+TET，BLM+VRP；3组为 5-FU+TET，5-FU+VRP；4组为DDP+TET，DDP+VRP。将上述每组中的两种药物分别处理HNE-1实验细胞。以不加任何药物的HNE-1、细胞为对照组。（2）FCM检测不同药物作用下细胞的周期改变：取对数生长期 HNE-1（1 × 107/mL），以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 2 次，加入3mL无血清RPMI-1640培养液使细胞同步化，12h后将无血清培养液弃去，换为3mL含10%小牛血清RPMI-1640培养液，除对照组外，为4种抗肿瘤药分别与TET、VRP联用，各药物加入量分别为 TET （1.5ug/mL）、VRP（0.1ug/mL）VCR（1.5ug/mL）、BLM（1.5ug/mL）、DDP（1.0ug/mL）、5-Fu（2.1ug/mL）。24h 后收集细胞，胰酶消化，PBS液洗涤2次，乙醇固定后，0.05%PI染色30min，上机检测，以Modfit LT 2.0软件分析细胞周期。以上药物浓度由本课题组前期研究得出，为抑制率低于10%的低毒剂量。

2 结果

2.1 对照组细胞周期的测定 不加任何药物的HNE-1细胞周期分布：G0/G1为45.44%，S为45.07%，G2/M为9.49%。

2.2 各用药组药物对HNE-1细胞周期的影响 见表1～表4。表1示VCR与VRP、TET联用使细胞在G0/G1期阻滞；表2示BLM与VRP作用，使细胞发生G0/G1期阻滞，处于该期的HNE-1细胞为79.95%；BLM与TET作用，使细胞发生G2/M期阻滞，处于该期细胞数为50.77%；表3示TET和5-Fu药物相互作用促使细胞周期变化，发生明显的G0/G1期阻滞；表4示TET和DDP药物相互作用促使细胞周期变化，发生明显的 G0/G1期阻滞。综上所述，可知：（1）TET、VRP与4种抗肿瘤药物相互作用结果相似，均可导致实验细胞株发生G0/G1阻滞。（2）DDP和5-Fu与 TET、VRP相互作用较 VCR和BLM显著。

表1 VCR与药物相互作用对细胞周期的影响

表2 BLM与药物相互作用对细胞周期的影响

表3 5-Fu与药物相互作用对细胞周期的影响

表4 DDP与药物相互作用对细胞周期的影响

3 讨论

研究发现，TET具有极强的体外逆转MDR的作用，其体外逆转MDR的活性是维拉帕米的10倍，能完全逆转MCF-7/ADR和KBV200细胞株的耐药性，其机制为通过调节P-gp增强MDR相关性药物的细胞毒性[3]。Hollstein等[4]的体内实验证明，TET在体内能通过降低多药耐药基因表达和DNA拓扑异构酶活性而干扰多药耐药的产生。总之，现有研究表明，TET毒副作用小，不影响化疗药物药代动力学，是非常具有开发前景的新一代MDR逆转剂[5，6]。但是粉防己碱在头颈肿瘤细胞周期方面的研究鲜有报道。

抗肿瘤药物常通过引起肿瘤细胞DNA损伤而导致细胞周期阻滞。有DNA损伤的细胞常被阻滞在G1期，防止受损的DNA进入S期复制；或被阻滞在G2期，以防止在M期进行异常分裂[3]。将细胞阻滞在G1期或G2期，会使大部分含DNA损伤的细胞在未得到修复的情况下进入细胞分裂期，导致细胞的增殖性死亡增加，理论上能够提高化疗的敏感性。在长期的临床实践及实验研究中，人们已发现抗肿瘤药物与中医药联合应用能提高临床疗效，优于单纯西药治疗，但对其机制的了解还不够深入。

本研究以鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象，采用流式细胞仪检测天然药物TET和VRP与4种常用抗肿瘤药物联合应用对两细胞株细胞周期的影响，结果显示，TET与肿瘤药物相互作用，可使鼻咽癌耐药细胞株和非耐药细胞株均产生细胞G1期阻滞，抑制细胞增殖，这与经典化疗增敏剂VRP相似，其中VCR与药物相互作用结果同BLM相似，而DDP和5-Fu结果相似，其作用较VCR和BLM显著。本研究显示，天然药物TET和经典化疗增敏剂VRP均能通过诱导鼻咽癌细胞G1期阻滞从而产生化疗增敏作用，这为进一步将TET作为化疗增敏剂和肿瘤多药耐药逆转剂提供了依据。

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