参元丹晚期药理预适应对大鼠缺血再灌注心肌PKC及HSP70的影响1)

杨洪志,尚菊菊,温庆祥,李爱勇,刘卫红,耿建国,刘红旭

缺血性预适应(ischemic preconditioning,IPC)是一种内源性保护机制,即短暂的缺血后能耐受随后较长时间的缺血损伤。药理性预适应就是用药物替代缺血产生缺血预适应样保护作用。IPC介导的心肌保护作用发生于两个不同的时相。早期预适应(early protection,EP)于IPC后立即出现,2 h～3 h消失。之后数小时后出现第二窗的晚期预适应(delayed protection,DP)。现对益气逐瘀法预适应大鼠缺血再灌注心肌蛋白激酶C(PKC)及热休克蛋白(HSP)的影响进行研究,以期阐明益气逐瘀中药的药理预适应性的心脏保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Wistar大鼠140只,雌雄各半,体重274 g±42 g,鼠龄4月左右,SPF级。由北京天桥实验动物技术有限公司提供。大鼠饲养和实验均在北京市中医研究所SPF级实验动物室内进行(实验动物室许可证号:SCXK11-00-0008)。

1.2 药物与器械 参元丹(SYD)胶囊为北京中医医院院内制剂,主要组方:黄芪、党参、元参、丹参、土元、水蛭等,批号:京药制字Z20053327,北京中医医院药剂科制。根据临床参元丹应用剂量,等效换算后的7倍剂量为大鼠灌胃剂量。戊巴比妥钠(BDH,AR级,使用前用灭菌注射用水配制成3%的浓度)。四通路生理记录仪(型号:AD INSTRUM ENTS Powerlab),动物用呼吸机(型号:VL-8,上海奥尔科特科技有限公司)、721型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)、离心沉淀机(型号:Sigma-3-18K)、北航三高CMIAS99C型彩色病理图像分析仪等。

1.3 动物模型制备 心肌梗死模型制作参考陈金星等[1]方法。机械性缺血预适应模型的参考心肌梗死模型制作方法。

1.4 分组及给药方法 将大鼠随机分为6组,每组10只,雌雄各半。对照组(control):不做任何处理;再灌注组(IR):缺血 30 min,再灌2 h;晚期假性缺血预处理组(SIPC/SWOP):3个机械性缺血预适应时只穿线,恢复24 h后,进行再灌注组过程;晚期缺血预处理组(IPC/SWOP):3个机械性缺血预适应后,恢复24 h进行再灌注组过程;晚期药物预处理加缺血预处理组(DIPC/SWOP):灌药2 h后,进行 3个机械性缺血预适应,恢复24 h后进行再灌注组过程;晚期药物预处理组(DIR/SWOP):灌药24 h后,进行再灌注组过程。

处理方法:末次给药2 h后戊巴比妥钠腹腔麻醉,50 mg/kg,将动物背位固定在鼠台上,用6号针头置于四肢皮下,并与心电图机肢导联相连,监测Ⅱ导联心电图麻醉后和梗死后的变化,根据Ⅱ导联心电图的变化,以T波改变判断心肌缺血程度和药物作用。观察2 h后心脏取血,检测生化指标。取血后,沿左右心耳剪取心脏,保留心耳以下部分,浸入甲醛溶液固定,72 h后脱水,包埋,制成蜡块,以备染色及切片。

部分组织标本浸入10%中性甲醛液中固定72 h后,逐级乙醇脱水,石蜡包埋,卡切片机间断均匀切片,57摄氏度水浴捞片,烘片机烘干,制成组织切片备检。对病理切片进行免疫组化染色,光学显微镜观察受损血管病理组织形态学改变,协同使用彩色病理图像分析,测定PKC及HSP70表达情况。

2 结 果

经HE染色后,20倍光学显微镜下观察,梗死组织细胞肿胀、变形,细胞之间的界限不明显,甚至很多细胞破裂,细胞质流入细胞间隙。细胞间质增生,细胞排列杂乱。

2.1 各组不同的处理方法对大鼠心肌梗死面积的影响 对照组以心尖至切取部位最短垂直距离为测量标准,其余各组以心尖至梗死部位的最短垂直距离为测量标准,反映心肌梗死面积的大小。晚期缺血预处理组、晚期药物预处理加缺血预处理组、晚期药物预处理组与再灌注组比较,梗死面积均减小(P＜0.01)。SYD能够代替心绞痛的缺血、缺氧的刺激,减小心肌梗死面积,具有晚期药理性预适应的心脏保护作用。详见表1。

表1 各组心尖至梗死部位的最短垂直距离(±s)

表1 各组心尖至梗死部位的最短垂直距离(±s)

组别 n 最短垂直距离(μ m)对照组 10 246.50±8.18再灌注组 10 85.50±13.631)晚期假性缺血预处理组 10 88.70±10.511)晚期缺血预处理组 10 144.10±21.921)2)晚期药物预处理加缺血预处理组 10 150.10±20.311)2)晚期药物预处理组 10 113.90±7.351)2)与对照组比较,1)P＜0.01,与再灌注组比较,2)P＜0.01

2.2 PKC的表达情况分析 PKC主要表达在细胞质和细胞膜,在细胞核上很少表达。它的经典表达方式是围绕着蓝色细胞核的棕褐色分布,而形成了大体的细胞形状。PKC在正常的心肌细胞中基本不表达,或者仅有少量的表达,这种表达在显微镜下肉眼难以看到。所以,排除特殊情况后,PKC一旦表达成阳性,就说明这种表达有意义。

在对照组和再灌注组的心肌组织中,PKC基本不表达;晚期假性缺血预处理组、晚期药物预处理加缺血预处理组、晚期药物预处理组亦没有PKC表达。晚期缺血预处理组大鼠心肌组织中,PKC表达为细胞核,考虑属于表达失真。由于同时实验的其他组并无此失真情况发生,考虑可能的原因有3种:一是镜下控制显色的时间过长;二是晚期缺血预适应和参元丹的效应促使PKC在细胞核上表达;三是其他未知的原因发生。

2.3 HSP70的表达情况 HSP70在正常的心肌细胞中基本不表达,或者仅有少量的表达,这种表达在显微镜下肉眼难以看到。对照组、再灌注组和晚期假性缺血预处理组的HSP70没有表达。HSP70表达丰富,即晚期缺血预处理组和晚期药物预处理组加缺血预处理组的HSP70大量表达,说明缺血预处理的心肌保护作用机制与HSP70有关,与文献报道相符[2]。晚期药物预处理组加缺血预处理组的HSP70表达有SYD作用存在;参元丹的心肌保护作用机制与HSP70有关。

3 讨 论

1986年M urry等[3]首次在犬心报道,并将此现象命名为IPC。IPC的机制是通过触发体内某些活性物质的活性,随后激活某些细胞内的信号传导途径,激活后的信号传导途径通过一些效应因子而发挥心肌保护作用。ATP敏感钾通道是受体激活后的效应因子最终作用部位。IPC介导的心肌保护作用发生于两个不同的时相。PKC主要在快速相中起作用,HSP主要在延迟相中起作用[4,5]。

缺血预适应对于心肌具有强大的保护作用,但不能应用于临床,因此,药理性预适应的研究应运而生。SYD治疗不稳定心绞痛(血瘀证)临床综合疗效总有效率在87.1%～91.3%。部分疗效机制可能与促进血管内皮修复有关[6-8]。SYD可以拮抗PHE引起的血管平滑肌收缩、抗垂体后叶素引起的大鼠急性心肌缺血、降低大鼠急性心肌缺血时血浆NE、DA及ET、ET/NOS比值的升高、抑制动脉内皮损伤后血管内膜过度增生、调整动脉内皮损伤大鼠ET/NOS比值及AngⅡ水平[9-12]。

本研究显示,SYD具有晚期药理预适应样作用;晚期假性缺血预处理组、晚期药物预处理加缺血预处理组、晚期药物预处理组没有PKC表达,提示PKC没有参与晚期缺血预适应的细胞内信号转导。晚期缺血预处理组、晚期药物预处理加缺血预处理组均有HSP70大量表达,晚期药物预处理组亦有HSP70表达,提示晚期缺血预处理的心肌保护作用机制与HSP70有关,SYD具有独立的晚期药理预适应作用,晚期药物预处理组加缺血预处理组的HSP70表达有SYD作用存在;SYD的心肌保护作用机制与HSP70有关。

SYD具有晚期药理预适应样心肌保护作用,减小心肌梗死面积;SYD晚期预适应心肌保护作用的机制可能与HSP70的介导有关;SYD晚期预适应可能与缺血预适应协同发挥心肌保护作用。

[1]陈金星,王硕仁,赵明镜,等.活血益气药不同剂量配伍对心梗后心衰大鼠心脏系数及心功能的影响[J].中国中药杂志,2003,28(5):446-449.

[2]郭利平,张萌,杜嵘,等.丹酚酸B预适应对缺氧复氧损伤细胞热休克蛋白70mRNA表达的影响[J].天津中医药,2004,21(6):455-458.

[3]Murry CE,Jenning s RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74:1124-1136.

[4]Akihito.T he cardioprotective effects of ischemic preconditioning are not mediated by adenosine receptors in rat hearts[J].Circulation,1993,87:1642.

[5]Tritto RC,Koutos MC,Loesser KE et al.Oxygen tadicals can induce preconditioning in rabbit hearts[J].Cir Res,1997,80(5):743-748.

[6]刘红旭,金玫,王振裕,等.参元丹煎剂治疗不稳定心绞痛(血瘀证)113例临床观察[J].中医杂志,1999,(4):219-222.

[7]刘红旭,金玫,王振裕,等.参元丹与合心爽治疗不稳定性心绞痛血瘀证疗效观察[J].中国中医急症,2003,12(4):293-294.

[8]刘红旭,尚菊菊,王振裕,等.参元丹与通心络胶囊治疗不稳定型心绞痛血瘀证对比研究[J].中国中医急症,2007,16(3):255-257.

[9]周萍,刘红旭,金玫,等.参元丹对去氧肾上腺素诱发家兔主动脉环收缩的拮抗作用及与内皮功能的关系[J].北京中医,2003,22(4):56-57.

[10]刘红旭,周萍,赵子厚,等.参元丹对垂体后叶素诱发的大鼠急性心肌炎缺血影响[J].中华中西医临床杂志,2004,4(5):591-593.

[11]刘红旭,尚菊菊,赵子厚,等.参元丹对动脉内皮损伤大鼠血管内膜增生影响研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2006,4(2):124-125.

[12]刘红旭,尚菊菊,赵子厚,等.参元丹胶囊对动脉内皮损伤大鼠内皮素、一氧化氮合酶、血管紧张素Ⅱ影响研究[J].中华中医药杂志,2006,21(12):743-746.