姜黄素抗脑缺血再灌注损伤作用与MAPK信号通路的相关性分析

王晓静,吴华璞,李子广,郭道华

缺血性脑血管病(ICVD)是威胁人类健康与生存的主要疾病之一,治疗中重建血流或增强血供是损伤修复的必需条件,但同时带来的再灌注损伤也备受关注。细胞信号转导在脑缺血再灌注损伤中的作用日趋受到重视,其中尤以丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路研究最为透彻。姜黄为姜科姜黄属植物的干燥根茎,姜黄素(curcumin,Cur)为姜黄的主要活性成分之一,因其毒副反应小,现广泛用作色素、食品添加剂及调味品。研究表明姜黄素具有抗炎、抗氧化、清除自由基、防癌抗癌、保肝护肾等药理学作用[1-5],并可通过多种机制抗缺血再灌注损伤,用于重要器官缺血性疾病的治疗。本研究通过建立大鼠局灶性脑缺血实验模型,检测M APK信号转导通路三大成员细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端(JNK)及p38MAPK的表达,观察姜黄素抗脑缺血再灌注损伤作用与MAPK信号转导通路的相关性。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂 姜黄素:BIOMOL公司产品;溶媒(DMSO):宜兴市展望化工试剂厂生产,批号:020822,DMSO助溶配制成0.4%的姜黄素溶液;尼莫地平(nimodipine,Nim)注射液:德国拜耳医药保健股份公司产品;兔多抗p38MAPK,鼠单抗 p-p38MAPK,兔多抗 ERK1、ERK2,鼠抗人β-action,山羊抗兔IgG,山羊抗鼠IgG:中杉金桥生物技术有限公司;鼠抗人p-ERK1/2:Santa Cruz公司;兔多抗C-Jun protein:北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 实验动物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,普通级,体重250 g～280 g,蚌埠医学院实验动物中心提供。

1.3 大鼠局灶性脑缺血模型制备及实验分组 SD大鼠84只,随机分为 7组,每组12只,分别为假手术(SH)组、缺血再灌注(I/R)组、尼莫地平(0.4 mg/kg)组、姜黄素(20 mg/kg、40 mg/kg、80mg/kg)组及DMSO组,其中6只用于神经行为学评分,另6只用于Western blot检测。参照Longa法[6]稍加改进制作大鼠相应中动脉(MCAO)试验模型。分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及翼颚动脉(ICA分支),结扎ECA后,在其近心端剪一小口,用直径0.2 mm尼龙线经小口插入,经分叉处轻推入ICA。当尼龙线插入距分叉1.8 cm～2.0 cm并有轻微阻力,表明栓线穿过大脑中动脉起始端至近端,阻塞了大脑中动脉主干起始部。2 h后拔出线栓实现再灌。假手术组仅插入5 mm左右,余操作同前。

1.4 神经行为学评分 待大鼠清醒后参考Longa等[6]方法进行行为障碍评分:无神经功能缺失者0分;提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直者1分;爬行时向对侧转圈者2分;爬行时身体向对侧倾倒者3分;不能自行行走,意识丧失者4分。

1.5 Western blot法检测 p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2及JNK蛋白的表达 BCA法测定脑组织提取物蛋白浓度。取适量标本经凝胶电泳分离后,转膜于PVDF膜上,随后脱脂奶封闭,分别孵育一抗、二抗,最后进行化学发光,图像经Bio-Rad图像采集系统分析处理。同时使用β-actin作内参照。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理。神经行为学评分数据为等级变量,采用中位数/四分位数法表示,组间比较采用Kruskal-Wallis分析法,Mann-Whitney分析法进行两两比较。多样本均数比较采用单因素方差分析,组间比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经行为学评分 大鼠清醒后,SH组未见行为学异常表现,评分均为0。I/R组均出现一定程度行为障碍,主要表现为提尾时左前肢不能充分伸展,爬行时向左侧倒、转圈,伴不同程度右侧Horner's征。与SH组相比I/R组神经行为学评分差异有统计学意义(P＜0.05),与 I/R组相比,Cur(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)组神经行为学评分差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 姜黄素对大鼠神经行为学评分的影响 分

2.2 ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达 ERK1/2表达各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。SH组可见p-ERK1/2表达,I/R组p-ERK1/2表达明显下降(P＜0.05),Cur(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)组p-ERK1/2表达明显上升(P＜0.05),其中尤以Cur(40 mg/kg)组最为显著。详见图1、图2。

图1 姜黄素对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响

图2 p-ERK1/2蛋白表达的相对灰度值

2.3 p38M APK、p-p38MAPK蛋白的表达 各组间p38M APK表达差异无统计学意义(P＞0.05)。SH组p-p38MAPK表达较少,I/R组p-p38MAPK表达明显升高(P＜0.05)。Cur(20mg/kg、40mg/kg 、80mg/kg)组p-p38MAPK表达明显下降(P＜0.05),其中尤以Cur 40 mg/kg组最为显著。详见图 3、图4。

图3 姜黄素对p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的影响

图4 p-p38M APK蛋白表达的相对灰度值

2.4 JNK蛋白的表达 SH组JNK蛋白表达不明显,I/R组JNK蛋白表达显著升高(P＜0.05),不同浓度姜黄素组JNK蛋白表达明显下降(P＜0.05),尤以Cur 40 mg/kg组为剧。详见图 5、图 6。

3 讨 论

ICVD临床极为常见,并以高发病率、高致残率、高病死率著称。脑缺血再灌注损伤机制涉及兴奋性氨基酸毒性、细胞信号转导、线粒体损伤、氧自由基大量生成、免疫炎症损伤、细胞凋亡学说等。缺血后神经细胞死亡主要表现为坏死和凋亡,其中缺血中心区以坏死为主,为不可逆性损伤,而缺血周围区以凋亡为主,及时恢复血供则是可逆的[7]。近年来,随着对细胞信号转导研究的日益加深,MAPKs超家族在调控细胞凋亡中的作用也日渐受到重视。M APKs超家族存在于所有真核生物中,为一族含丝氨酸/苏氨酸残基广泛分布于细胞浆内的蛋白激酶,是将细胞外刺激信号传递到细胞核,引起核反应的重要信号传导系统,是细胞内、外信号转导的共同途径或汇聚点[8,9]。现已明确的M APK信号转导通路共有5条分别为JNK/应激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK、ERK3/4和 ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)信号转导通路,目前研究较多的为前三条通路。研究表明MAPKs超家族与细胞凋亡关系密切,活化的MAPKs一方面可留于胞浆激活一系列蛋白激酶;同时可发生核转位,通过调节目的基因如 c-Jun、c-fos、p53、c-myc、bax 等的表达调控细胞凋亡。各种刺激通过ERK生存通路促进细胞存活、抑制凋亡;JNK与P38MAPK通路则参与介导炎症、应激反应中的细胞凋亡。仅JNK和p38MAPK激活不足以引发神经细胞凋亡,只有JNK和p38MAPK通路持续激活同时伴ERK通路同步抑制才可诱导细胞凋亡。

姜黄素为姜黄属植物中一种略带酸性的黄色酚性物质,为姜黄属植物发挥作用的最重要活性成分,中医认为姜黄能行气、散风活血、通经止痛,临床应用广泛。姜黄素以其清除自由基、抑制脂质过氧化、减轻钙超载及调节凋亡相关基因等作用用于抗缺血再灌注损伤[10]。研究表明姜黄素对缺血组织JNK通路有一定抑制作用,亦可上调热休克蛋白70(HSP70)、Bcl-2/Bax比值抗凋亡。亦有报道称姜黄素预处理后对脑水肿有一定保护作用。本实验结果显示,姜黄素组神经行为学评分明显降低,表明姜黄素对脑缺血再灌注损伤有确切保护作用;Western blot法检测结果表明,姜黄素组较I/R组p-p38MAPK及JNK蛋白表达明显降低,而p-pERK1/2蛋白表达显著上升,其中尤以姜黄素(20 mg/kg)组效果最为明显,提示姜黄素抗脑缺血再灌注损伤作用可能与抑制p38MAPK和JNK/SAPK信号转导通路,增强ERK1/2信号转导通路有关。

目前通过调节信号通路进行疾病治疗日渐成为研究热点,上调ERK1/2,同时下调p38MAPK和JNK/SAPK信号转导通路可能成为脑缺血再灌注损伤治疗新靶点。但对其下游作用基因,以及信号通路间相互作用仍需进一步深入研究,以为临床ICVD治疗提供新的理论依据。

[1]鲍华英,陈荣华.姜黄素的研究进展[J].国外医学:儿科学分册,2003,30(5):254-256.

[2]Asai A,Miyazawa T.Dietary curcuminoids prevent high fat diet induced lipid accumulation in rat liver and epididymal adipose tissue[J].Nutr,2001,131(11):2932-2935.

[3]Linj K,Shin CA.Inhibitory effect of curcumin on xanthine dehydrogenase/oxidase by phorol-12-myristate-13-acetate in NIH3T3 cell[J].Carinogenesis,1994,15(8):1717-1721.

[4]Rukkumani R,Balasubashini M,Vishwanathan P,et al.Comparative effects of curcumin and photo-irradiated curcumin on alcohol and polyunsaturated fatty acid-induced hyperlpidemia[J].Pharmacol Res,2002,46(3):257-264.

[5]T irkey N,Kaur G,Yij G,et al.Curcumin,a diferuloylmethane,attenuates cyclosporine-induced renal dysfunction and oxidative stress in rat kidneys[J].BMC Pharmacol,2005,5:15-25.

[6]Longa EZ,Weinstein P R,Carlon S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[7]冯建利,姚博,闫鹏.大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡诱导因子的表达及其与神经细胞凋亡的关系[J].中国老年学杂志,2007,27(10):1955-1957.

[8]许川山,余茜,吴士明,等.M APK级联传导途径与脑缺血性损害[J].现代康复,2001,5(7):62-63.

[9]Xia Z,Dickens M,Raingeaud J,et al.Opposing effects of ERK and JNK-p38MAP kinases on apoptosis[J].Science,1995,270(24):1326-1331.

[10]徐丙发,吴华璞,祝晓光.姜黄素对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用[J].蚌埠医学院学报,2007,32(6):637-639.