康脑液对脑缺血再灌注损伤大鼠血清及脑组织匀浆SOD、MDA、NO的影响1)

薛 茜,邹玉安,韩 敏,张 静

脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病重要的病理生理过程,防治脑缺血再灌注损伤一直是目前缺血性脑卒中治疗的热点,中药制剂对于脑缺血再灌注损伤后的保护作用受到众多学者的重视。本实验应用大鼠复制脑缺血再灌注损伤模型,以益气活血化瘀、清热平肝、熄风定惊法立方制成的康脑液进行干预,观察用药前后对血清和脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量变化,探讨康脑液对脑缺血再灌注损伤的保护作用,为脑卒中的临床预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性标准二级(清洁级)Wistar大鼠30只(购自中国医学科学院实验动物中心,体重250 g～350 g)。随机分成脑缺血再灌注模型组(模型组)、康脑液干预组及假手术组,每组各10只。

1.2 脑缺血再灌注损伤模型的复制 实验大鼠采用Bannister[1]建立的颈动脉引流法。肌肉注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg全身麻醉,舌静脉注射0.5%(1 mL/kg)肝素抗凝。分离双侧颈总动脉及右侧颈浅静脉,用动脉夹夹闭左侧颈总动脉,同时结扎右侧颈总动脉近心端及右侧颈浅静脉远心端,用自制的插管在右侧颈总动脉与右侧颈浅静脉间搭桥,使来自基底动脉的血流经Willis环由右侧颈内动脉、颈总动脉逆向引流至颈静脉造成脑缺血,90 min后开夹并切断右侧颈总动脉引流,使脑血流再灌注。假手术组除不行血管搭桥及颈总动脉夹闭外,余手术过程相同。

1.3 中药方剂组成、制备及给药方法 组成:黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤、三七粉等。制备:除三七粉外,常规煎煮两次,再将两煎的上清液混合,文火煎浓缩至70 mL,给药前将三七粉溶于药液中。给药方法:每日灌胃给药1次,连续15 d,每只鼠每次给药2 mL(给药量根据公式[2]计算,相当于原生药3.8 g)。给药第15 d,给药后2 h复制脑缺血再灌注模型。模型组及假手术组以等量生理盐水代替中药。

1.4 指标测定 动物缺血90 min再灌注180 min后颈总动脉取血清5 mL置于离心管中,4℃冷藏备用。用预冷的生理盐水制备10%脑组织匀浆,2 500 r/min离心10 min,取上清液-80℃保存备检。以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力;以硫代巴比妥酸法(TBA)测定MDA含量;以硝酸还原酶法测定NO活力;以双缩脲法检测脑组织蛋白含量。按试剂盒说明严格操作。

1.5 试剂和仪器 SOD测定试剂盒(批号 20040812)、MDA测定试剂盒(批号20040828)及NO测定试剂盒(批号20040511)均购自南京建成生物工程研究所。721型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.6 统计学处理 运用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,再用LSD法进行两两比较,P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠血清SOD、MDA、NO的影响(见表1)与假手术组相比,模型组血清中MDA、NO含量明显增高,SOD含量明显降低(P＜0.01);与模型组比较,康脑液干预组血清中MDA、NO含量明显降低,SOD含量明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠血清SOD、MDA、NO的影响(±s)

表1 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠血清SOD、MDA、NO的影响(±s)

组别 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手术组 10 195.99±41.84 3.50±0.51 45.12±8.15模型组 10 125.66±20.791) 5.41±1.541) 83.67±13.671)康脑液干预组 10 182.81±17.622) 3.26±1.263) 55.14±10.603)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆SOD、MDA、NO的影响(见表2)与假手术组相比,模型组脑组织匀浆中MDA、NO含量明显增高,SOD含量明显降低(P＜0.01);与模型组相比,康脑液干预组脑组织匀浆中MDA、NO含量明显降低,SOD含量明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆SOD、MDA、NO的影响(±s)

表2 康脑液对缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆SOD、MDA、NO的影响(±s)

组别 n SOD U/mg MDA mmol/mg NO μ mol/mg假手术组 10 38.84±0.85 1.75±0.40 9.30±1.76模型组 10 29.40±3.811) 3.26±0.851) 18.49±4.921)康脑液干预组 10 40.15±3.163) 2.12±0.643) 11.60±1.632)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤可导致严重的迟发神经元损伤,影响患者的预后和功能恢复,期间可发生复杂的继发性改变,加重组织损伤。机体在正常情况下,氧自由基由于机体的代谢损伤而产生并依生理需要及时消除,在脑缺时,自由基清除酶活性降低,自由基产生急剧增多,可广泛的攻击富含多不饱和脂肪酸的神经细胞膜和血管,引发脂质过氧化的瀑布效应,最终导致细胞功能紊乱,膜功能丧失,线粒体破坏,神经元坏死。目前多数学者认为自由基引发的脂质过氧化反应主要是在缺血后再灌注的早期[2],细胞膜、细胞器膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,磷脂被降解而变性失能。SOD是主要的抗氧化酶之一,它能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,阻断自由基的毒性反应[3],清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤。氧自由基损伤细胞膜结构,生成大量脂质过氧化物,最终产物是 MDA,MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物,间接反映了机体自由基产生的量和体内脂质过氧化反应的程度,MDA的量常可反映机体内脂质过氧化的程度。NO是体内发现的第一个气体信息分子,在神经系统中发挥着信使分子的重要作用,参与多种生理功能调节,脑内NO在脑缺血再灌注损伤中的作用是双重性的[4],一方面可以缩小梗死面积,增加皮质供血;另一方面,可与缺血产生的氧自由基协同作用,造成神经细胞损伤。缺血后数小时至数天内产生的NO具有毒性[4],主要机制有:通过氧自由基起细胞毒性作用;NO使各种含铁-硫的酶失活,阻断细胞内能量合成及DNA的复制产生细胞毒性作用;NO引起蛋白质的ADP-核糖化,使蛋白质结构和功能改变,并导致迅速的能量耗竭,引起细胞死亡;NO引起多巴胺大量释放而起神经毒性作用。随着缺血加剧及再灌注时间的延长,NO的含量明显增多,加剧缺血再灌注损伤,可见NO水平与脑组织损伤程度相关[5,6]。

康脑液为自拟方,由黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤、三七粉等组成,黄芪味甘性微温,补气升阳,益卫固表,具有血管扩张、改善血液循环、兴奋中枢神经作用;丹参味苦性微寒,活血祛瘀、消肿安神,具有扩张血管、增强血流量的作用;川芎味辛性温,活血行气,具有扩张血管、改善机体缺血缺氧状态之功效;葛根味甘性辛凉,发表解肌、生津止渴,具有止痛、扩张脑血管的作用;钩藤味甘性微寒,熄风定惊、清肝平肝,具有镇静、扩张周围血管、调节血压的功效;三七粉味甘性微苦,化瘀止血,消肿定痛,具有增加血流量、调整血压降低耗氧量、抗血小板聚集之功效。本实验结果显示,脑缺血90 min和再灌注180 min后,模型组大鼠血清和脑组织匀浆中MDA、NO含量显著高于假手术组,SOD含量显著低于假手术组;给予康脑液干预治疗后,能显著提高大鼠血清和脑组织匀浆中SOD的活性,降低MDA、NO的含量。表明康脑液方药能较好的提高细胞抗氧化和抑制其脂质过氧化作用,因而对缺血再灌注损伤具有保护作用。

[1]Bannister CM,Sonia A.Ischemia and revascularzation of the middle cerebral territory of the rat brain by manipulation of the blood vessels in the neck[J].Surg Neurol,1984,21:351.

[2]Coert BA,Anderson RE,Meyer FB.A comparative study of the effects of two nitric oxide synthase inhibitors and two nitric oxide donors on temporary focal cerebral ischemia in the wistar rat[J].J Neurosurg,1999,90:332-338.

[3]张敬伟.NO,SOD与缺血性脑血管病的关系[J].中国误诊学杂志,2005,5(5):900.

[4]De Alba J,Cardenas A,M oro MA,et al.Down-regulation of neuronal nitric oxide sy nthase by nitric oxide after oxygen-g lucose deprivation in rat forebrain slices[J].J Neurochem,1999,72(1):248-254.

[5]孟宪芳,施静,刘晓春,等.大脑海马脑片缺血-再灌注模型中一氧化氮及一氧化氮合酶的变化[J].中国脑血管病杂志,2004,1(10):457-460.

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