阿托伐他汀抗动脉粥样硬化作用的实验研究

药红梅,吕吉元

在临床工作中,如何减少、避免冠心病事件的发生是目前心血管领域研究的热点和难点,主要措施为去掉斑块和稳定斑块[1]。许多大型临床试验[2,3]表明他汀类药物除了具有调脂、减少再狭窄外,还具有稳定粥样斑块、抑制血栓形成、恢复血管内皮细胞功能等作用。本研究旨在探讨阿托伐他汀调脂及抗动脉粥样硬化(AS)作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 雄性Wistar大鼠(山西医科大学生理教研室动物室),阿托伐他汀(ATO,商品名立普妥,每片20 mg,德国Godecke GmbH公司生产),VD3注射液(上海通用药业股份有限公司),胆固醇(成都科龙化工试剂厂),猪胆盐(北京奥博星生物技术有限责任公司),丙基硫氧嘧啶(上海复星朝晖药业有限公司),HEPES缓冲液,血脂系列检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)放射免疫试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所),大鼠高敏C反应蛋白(hs-CRP)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)酶联免疫吸附法(ELISA)测定试剂盒(美国BPB公司生产,大连范邦试剂公司分装),NF-κ B p65单克隆抗体(Santa Cruze公司),PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒及其余免疫组化相关试剂(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 动物分组 24只健康雄性 Wistar大鼠,体重 180 g～220 g,适应性喂养1周后,随机分为两组。对照组8只,饲喂正常饲料,动脉粥样硬化模型组16只,饲喂高胆固醇饲料,并在饲养开始时,腹腔注射 VD 32 mL/kg(6×105 U/kg)。对照组则腹腔注射生理盐水2 mL/kg。12周后模型建成。将建模成功的16只模型大鼠随机分为模型组和药物组,每组8只。药物组大鼠给予10 mg/(kg◦d)阿托伐他汀进行灌胃治疗,对照组和模型组以蒸馏水灌胃,治疗共持续8周。

1.3 观察指标与方法 于治疗前后分别测定大鼠血清血脂系列[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、动脉粥样硬化指数(AI)]、MDA、SOD、IL-6、TNF-α、hs-CRP、ox-LDL含量的变化情况,以及治疗后心肌 NF-κ B的激活情况。血脂、MDA、SOD采用化学法测定;IL-6、TNF-α采用放射免疫法测定;hs-CRP、ox-LDL采用ELISA法测定;NF-κ B采用免疫组织化学法测定。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差(±s)表示,采用配对t检验和方差分析,P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组治疗前后血脂比较(见表1)

表1 各组治疗前后血脂比较(±s)

表1 各组治疗前后血脂比较(±s)

组别 n TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)AI对照组 治疗前 8 1.63±0.19 0.65±0.16 0.30±0.04 1.01±0.26 4.45±0.86治疗后 8 1.80±0.45 0.32±0.211) 0.27±0.09 1.21±0.27 7.17±3.72模型组 治疗前 8 13.91±4.65 0.71±0.43 0.38±0.09 13.22±5.17 33.54±12.70治疗后 8 10.53±5.07 0.42±0.23 0.40±0.12 9.56±5.45 27.90±4.30药物组 治疗前 8 13.56±5.32 0.62±0.32 0.33±0.12 12.63±4.56 54.89±15.60治疗后 8 9.09±2.772) 0.29±0.151) 0.30±0.22 8.68±3.041) 32.01±16.731)与同组治疗前比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 各组治疗前后各炎症因子比较(见表2)

表2 各组治疗前后炎症因子比较(±s)

表2 各组治疗前后炎症因子比较(±s)

组别 n IL-6(pg/mL)TNF-α(ng/mL)hs-CRP(ng/dL)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 8 47.18±17.61 49.02±18.50 1.36±0.20 1.59±0.37 51.27±20.60 53.83±26.39模型组 8 43.98±16.61 44.89±9.44 2.04±0.53 2.25±0.44 62.20±22.53 73.80±21.50药物组 8 49.68±9.44 48.72±17.12 1.80±0.44 0.85±0.182) 56.67±23.23 49.56±28.501)与同组治疗前比较,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.3 各组治疗前后M DA、SOD和ox-LDL比较(见表 3)各组治疗前后 MDA、SOD均无统计学意义,但药物组有降低MDA,升高SOD的趋势。药物组治疗后ox-LDL水平显著低于治疗前(P＜0.05)。

表3 各组治疗前后MDA、SOD和ox-LDL的比较(±s)

表3 各组治疗前后MDA、SOD和ox-LDL的比较(±s)

组别 n MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)ox-LDL(ng/dL)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 8 4.39±1.82 3.75±1.56 140.85±4.82 139.76±3.84 35.67±12.13 46.30±5.91模型组 8 5.22±1.42 4.17±1.19 141.46±4.59 142.03±3.08 115.45±10.45 119.10±11.36药物组 8 5.63±2.85 4.36±1.90 131.42±9.35 134.38±5.32 125.36±20.61 108.20±8.741)与同组治疗前比较,1)P＜0.05

2.4 各组NF-κ B的免疫组化检测结果 阴性对照是以PBS代替一抗所得的结果,可见核蓝染,胞浆不着色。NF-κ B正常情况下处于失活状态,存在于胞浆中,所以对照组可见蓝染的胞核,并有黄色颗粒物分布于胞浆。当NF-κ B被激活时,就会由胞浆进入胞核,称为核易位,在NF-κ B激活的阳性细胞中可见,胞核在蓝色的基础上着有棕色,呈现出深棕色,胞浆中黄色颗粒物减少。在本实验中,每张切片随机挑取3个视野,计数核易位的细胞数目,计算平均核易位率。NF-κ B核易位率:药物组为(9.37±4.28)%,对照组为(5.02±3.33)%,模型组为(15.40±10.09)%。药物组与对照组 NF-κ B核易位率明显低于模型组(P＜0.01)。

3 讨 论

他汀类药物是近十几年开发的三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,能有效地降低 LDL,提高HDL。经 4S[4]、CARE[5]、LIPID[2]、WOS[6]、AFCAPS/TexCAPS[7]等大型临床实验已证实其对冠心病的一级和二级预防作用。许多年以来,人们将他汀类药物的药效单一归结于它的调脂作用。近来有研究发现除了调脂作用外,他汀类药物还有其他的抗动脉粥样硬化作用。

3.1 调脂作用 他汀类药物的调脂作用有助于AS斑块的形成,而它对内皮功能的改善、抑制平滑肌细胞的增殖和聚集、诱导平滑肌细胞的凋亡和抗炎等调脂外的作用不仅能减缓动脉粥样硬化斑块的形成,减小斑块大小,还能稳定斑块,阻止AS斑块的进一步发展,对于临床心血管事件的防治有重要意义。本研究结果显示,药物组明显降低 AS大鼠的血清TC、TG、LDL含量,表明阿托伐他汀具有明显的调节血脂作用。

3.2 抗炎作用 研究发现,他汀类药物在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中有潜在的抗炎和抗血栓作用,能抑制巨噬细胞因子的表达、NF-κ B的激活、对抗 ox-LDL诱导的一氧化氮合酶下调以及下调家族性高胆固醇血症患者升高的血清可溶性CD40L(sCD40L)水平,对动脉壁具有独立于降胆固醇外的保护作用[8]。本实验发现,药物组治疗后血中hs-CRP、TNF-α水平以及心肌组织中的NF-κ B水平均明显低于模型组,说明阿托伐他汀具有抑制炎症细胞在血管壁的积聚及减轻粥样斑块炎症的作用,阿托伐他汀抑制炎症的作用是其消退斑块、稳定斑块及降低临床心血管事件发生率的原因之一。

3.3 抗氧化作用 有研究表明,他汀类不但可以抑制LDL氧化,还可以减少巨噬细胞摄取LDL的能力[9]。有学者发现辛伐他汀、氟伐他汀可抑制ox-LDL的促鼠腹腔巨噬细胞生长作用。其他作者相继证实他汀类药物可抑制巨噬细胞产生超氧阴离子,减少ox-LDL的生成,抑制巨噬细胞表达清道夫受体及组织因子,减少ox-LDL的摄取[10,11]。本实验结果表明,ATO组治疗后ox-LDL治疗后较治疗前显著降低,即阿托伐他汀也同样具有降低ox-LDL的作用,从而抑制ox-LDL在AS发生发展过程中的作用,增强了斑块的稳定性。本实验同时检测了血SOD活力和MDA含量。SOD活力反映了机体清除氧自由基的能力,MDA反映了机体受氧自由基损害的程度。结果表明阿托伐他汀治疗前后比较差异无统计学意义,但有提高机体SOD活力降低MDA含量的趋势。阿托伐他汀具有独立于调脂外的抗炎、抗氧化等多方面的抗动脉粥样硬化作用。

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