经肛门直肠注射大鼠原位大肠癌模型的构建

陈 剑 ，武 华 ，陈春华

（1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医科大学第一医院普外科，山西太原 030001；3.江西省武宁县人民医院，江西武宁 332300）

大肠癌动物模型是大肠癌实验研究的基础。动物模型的构建，不仅是研究肿瘤预防的重要基础，还可用于大肠癌发生、发展及治疗等方面的研究。利用二甲基肼（1,2-dimethylhydrazine，DMH）作为工具药诱导大鼠大肠癌，这种前致癌物为结直肠癌动态和治疗性研究提供大量的动物模型[1-4]。如果以应用二甲基肼为基础，增加其他致癌因素作用于大鼠可提高大肠癌的诱发率，将有效缩短造模周期并节约成本。本实验分别以二甲基肼诱导、环磷酰胺抑制免疫为基础，应用大肠癌细胞肠黏膜下注射，以建立一种成功率高且可靠的大肠癌动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 二甲基肼（购自Sigma公司）分子量：133.2；颜色：灰白色，4℃避光保存。SW480大肠癌细胞株（山西医科大学生化教研室赠），环磷酰胺200 mg/支（购自江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.1.2 动物 4周龄Wistar大鼠60只，清洁级，近交系，雄性，购自山西医科大学动物中心。随机分成三组：二甲基肼组23只，环磷酰胺组23只，对照组14只，实验过程中出现死亡不计入实验。

1.2 方法及处理

1.2.1 细胞培养 人大肠癌细胞株SW480采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置37℃、5%CO2培养箱内培养，取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化后收集，以胎盘蓝检测细胞活性大于90%以上，加适量不含血清的RPMI 1640营养液配置成浓度为1×106个/ml的悬液备用。

1.2.2 二甲基肼组 将二甲基肼用生理盐水配成1%溶液，用4%NaOH溶液调成pH值为6.5～7.0，抽滤除菌，大鼠颈部皮下注射，30 mg/kg，1次/周，每周测体重1次，据体重调整剂量，至第8周末，按文献[5]的方法取大肠癌细胞悬液0.2 ml注入背侧肛门缘上2 mm直肠黏膜下；对照组仅皮下注射二甲基肼8周。

1.2.3 环磷酰胺组 取环磷酰胺用生理盐水配成10%溶液，200mg/kg，大鼠腹腔内注射，24 h后直肠黏膜下注射癌细胞，方法同二甲基肼组。

三组大鼠术前皆禁饮食 12 h，10%水合氯醛（0.3 ml∶100 g）腹腔内注射麻醉。

1.2.4 饲养条件及观察 大鼠于室温，12 h光照条件下饲养，自由饮水，癌细胞注射后继续饲养2周，观察实验期间大鼠的一般生长情况，如体重变化、运动情况、腹部体征等，着重观察肛门有无红肿、糜烂、结节、大便性状改变。

2周后处死大鼠，打开腹腔，观察有无腹水、粘连、脏器转移等情况，切取整段结直肠用生理盐水冲洗干净，计算肿瘤结节的数目、大小，测量瘤体横径。标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，连续切片，光镜观察。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，χ2检验比较组间、组内造模成功率差别，样本总数＜40例或理论频数＜1时，用Fisher精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠用药后的生长状况

注射二甲基肼后，大鼠未见明显异常反应；腹腔内注射环磷酰胺，出现短暂不适，0.5 h后恢复；注射癌细胞后逐渐出现活动量明显减少，精神萎靡，体重增长缓慢或停滞，毛发脱落，失去光泽，进食减少，部分大鼠出现腹泻、排便困难等情况。

2.2 取材后大体观察

实验结束取标本时，实验组可见大鼠直肠变硬，管腔变小，黏膜粗糙、充血水肿，皱褶变粗而不规则，组织变脆，可见结节状隆起，大小不等，色暗红，个别结节表面出血、坏死及或溃疡。结节多见于癌细胞注射处，肿块多为单发，肿块周围血管丰富，少数大鼠出现肠外组织浸润，未见远处转移灶，其中有2只大鼠肿块穿透肠壁与周围组织形成粘连梗阻并少量腹水，4只大鼠癌肿直径达1.0 cm，对照组4只大鼠降结肠可见结节形成，均为多发。其余大鼠大肠黏膜欠光滑并充血水肿，皱褶不规则，未见结节形成。

2.3 HE染色观察

大肠标本病理诊断有正常组织、不典型增生、腺癌，大肠癌总诱导率为32.7%，肠壁内肿块占96.0%。结节光镜下可见黏膜腺上皮拥挤增生或变浅消失，多呈高柱状排列，细胞核极性消失或分裂，浓染，演变为癌细胞，并以单层或多层排列，腺腔极不规则，局部有带蒂的间质突入腔内，弥漫于黏膜下层，并向肌层浸润生长，为典型的腺癌改变。实验结束时52只大鼠完成实验，共有19只在大肠壁上发现不同时期的结节，病理诊断为腺癌共17只。实验组：侵入黏膜下层16只，其中穿透浆肌层2只；对照组：不典型增生3只，原位腺癌1只。见表1。

表1 大鼠大肠结节病理分型和诱导成功率（只）

三种造模方法总体成功率差异有高度统计学意义 （χ2=6.024，P＜0.01），二甲基肼组与环磷酰胺组、二甲基肼组与对照组相比，差异有高度统计学意义（均P＜0.01），环磷酰胺组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

结直肠癌的发生及发展是一个多步骤、多阶段、多基因参与的过程，是饮食、环境、遗传、疾病等多因素相互作用的结果[6]。其主要造模方法可分为：DMH化学诱导法，肿瘤细胞种植法。DMH是一种有效诱导结肠癌动物模型的致癌原[7]，致癌作用确切，且有诱发大肠癌的特异性，其本身无毒，通过肝脏转化后转变成活性阳离子，并随胆汁排泄进入消化道，在结肠黏膜处发挥间接致癌活性[8]，促进大肠癌的发生。目前常用的化学致癌物主要包括DMH、苏木素、氧化偶氮甲烷、二甲基联苯胺和黄曲霉素等，主要通过皮下注射给药，其中有些药物在诱发大肠癌的同时常可诱发其他部位的肿瘤[9-10]。因此，DMH被更多地应用于大肠癌模型的构建。

另一种造模方法：肿瘤细胞种植法。SW480细胞株为人结肠高分化腺癌细胞株，直接在大鼠上种植其成瘤率偏低[11]，而它在裸鼠大肠癌模型的建立中使用最常见，且多见于皮下种植或结肠浆膜下种植，条件要求较高，操作相对复杂。另外小鼠寿命短，且免疫功能差，自然条件下易并发肺部感染死亡，而无法完成相对需时较长的实验研究；而机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展有密切关系，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高，而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制，二者互为因果[12]。大鼠自然免疫系统较完善，所以造模前应用环磷酰胺。它的主要毒副作用是免疫抑制，在作用于肿瘤细胞的同时也杀伤正常组织细胞，特别是生长旺盛的血液、淋巴组织细胞，而这些组织细胞是机体免疫防御系统的重要组成部分，破坏了机体的免疫系统，肿瘤就会迅速发展[13-15]。

在选择模型动物时，与小鼠相比，大鼠价格便宜，环境要求低，饲养简单，但自然条件下发生肿瘤是极少见的，如何克服这一困难对于肿瘤的成功诱导很关键。本实验选取Wistar大鼠作为模型动物及以DMH、环磷酰胺作为基础用药。阅读文献可知：DMH用药量为20～40 mg/kg不等，注射方法选取的部位不尽相同，有颈部皮下、腹部及背部皮下等；模型构建成功率也不尽相同，为20%～70%不等，因此，找到一种方法简单、成功率高、模型性质稳定的方法颇为重要。本实验应用经肛直肠黏膜下注射，对大鼠机体影响小，从而减小了混杂因素的干扰，亦符合大肠癌发生的结构基础。在大鼠皮下注射DMH 8周后，直肠黏膜形成炎性水肿状态下肠黏膜屏障受到破坏时注射肿瘤细胞，使肿瘤细胞更易定植于黏膜下，使造模成功率提高[16]。

在二甲基肼基础上种植癌细胞，两种促癌因素的作用下更加符合肿瘤发生的多因素和多阶段性，从实验结果来看，此方法不失为构建大肠癌模型的一种有效可行的造模方法；而大鼠大肠癌模型对评估人类结肠癌非常有价值，在研究肿瘤生物学和治疗中的重要性已经显现[17-18]，但由于实验时间短，未能就癌肿进一步浸润、转移等问题做更进一步的研究。

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