N+离子注入选育高转化15α-羟基左旋乙基甾烯双酮雷斯青霉菌株的研究

离子注入技术作为一种特殊的物理化学复合诱变源，自1986年余增亮等将其应用于生物学以来，在生物批种改良领域已取得了丰硕成果[1]。作为一种新的诱变源，低能离子注入和常规的辐射诱变及化学诱变有着明显的差异，常规的辐射诱变仅仅是利用能量交换，化学诱变考虑的也只是分子基团的交换，而低能离子注入生物体时同时存在能量交换、能量沉积、质量沉积及电荷交换四大效应。由于注入离子的电荷数、质量数、能量、剂量的组合不同，可以提供众多的诱变条件，使离子注入诱变具有突变谱宽、突变率高的特点，从而可以筛选到符合生产要求、能够提高产量的突变体[2,3]。

15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮(Gestodene)的重要中间体[4]，其核心技术是在左旋乙基甾烯双酮的C15位上连接一个α-羟基[5]，而雷斯青霉是对左旋乙基甾烯双酮进行C15α位羟化的常用菌株[6,7]。

作者采用N+离子注入技术对雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490进行诱变处理，以期得到适于工业生产的高转化率突变株，并考察该技术在霉菌选育方面的应用价值。

1 实验

1.1 菌种

雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC 10490，美国菌种保藏中心。

1.2 培养基

固体培养基(g·L-1)：麦芽提取物 20，葡萄糖 20，蛋白胨 1，琼脂粉 20，pH值自然。

液体培养基(g·L-1)：葡萄糖 30，玉米浆 10，NaNO32，KH2PO41，K2HPO40.5，MgSO40.5，FeSO40.02，KCl 0.5，pH值自然。

1.3 雷斯青霉孢子悬液的制备

在无菌条件下，挑取雷斯青霉菌种沙土孢子适量，均匀接种在斜面培养基表面。置于28℃恒温培养5～7 d。取新鲜的雷斯青霉孢子斜面一支，加入10 mL无菌生理盐水，洗脱孢子，移入装有灭菌玻璃珠的三角瓶内，振荡30 min，双层纱布过滤，得到无菌丝体的孢子悬液。调整孢子浓度为1×107个·mL-1，取上述单孢子悬浮液0.1 mL，均匀涂布于90 mm的灭菌培养皿中间区域，无菌风吹干。

1.4 低能离子注入

将含有雷斯青霉孢子的培养皿放入低能加速器(离子注入机)靶室，打开培养皿盖，靶室抽真空。用能量为30 keV的不同剂量的N+离子束进行注入。用1 mL无菌生理盐水洗脱，适当稀释后涂布在平板培养基上，于28℃培养2 d，用于单菌落的挑选和存活率的计算。

1.5 左旋乙基甾烯双酮15α-羟化实验

孢子斜面用无菌水制成孢子悬浮液，浓度为1.5×107个·mL-1，按3%接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，置于28℃、180 r·min-1的摇床上培养42 h后，按3‰的投料量加入左旋乙基甾烯双酮和6%的甲醇，继续转化培养120 h。

1.6 分析检测

不同时间取500 μL发酵液于离心管中，加入等体积乙酸乙酯萃取30 min，12 000 r·min-1离心5 min,取上清液100 μL，挥干乙酸乙酯，加入1000 μL甲醇溶解，用高效液相色谱法进行检测。高效液相色谱条件：C18柱(4.6 mm×250 mm)，流动相为甲醇∶水(80∶20)，流速1 mL·min-1，检测波长241 nm。

2 结果与讨论

2.1 离子注入诱变对雷斯青霉存活率和突变率的影响(图1、图2)

由图1可知，设定靶室抽真空时菌株的存活率为100%，随着N+注入剂量增加，存活率呈现较明显的先降后升再降的“马鞍型”变化趋势，这种特有的变化被认为是能量、动量作用下的损伤效应和质量、电荷作用下的保护和刺激综合作用的结果。

由图2可知，N+注入剂量为50×1014ions·cm-2时正突变率最高，达14.5%，恰好在“马鞍型”区域内。超过50× 1014ions·cm-2后，菌株突变率继续增加，而正突变率明显下降，这可能是因为，随着N+注入剂量的增大，DNA和生物膜等损伤严重导致。

图1 N+辐照的存活效应

图2 N+离子注入对菌株突变率及正突变率的影响

2.2 离子注入诱变对雷斯青霉菌落形态的影响

考察了N+注入剂量为50×1014ions·cm-2时菌株的变化情况，结果见图3。

图3 离子注入诱变后雷斯青霉的菌落形态

由图3可知，在50×1014ions·cm-2N+剂量下出现了5种不同菌落形态。摇瓶转化实验表明，3株突变株(突变株1、3、4)的转化率高于出发菌株。其中突变株1转化率最高，其单菌落形态较大，菌丝体呈白色，且生长旺盛，孢子呈深绿色且量大，菌落平整，无褶皱，边缘整齐，明显不同于其它突变株。由此可见，可以通过菌落形态的差异初步判断转化率可能较高的菌株，为雷斯青霉提供了良好的初筛方法。

在液体培养基中，突变株1的孢子发芽时间要比出发菌株短，摇瓶培养12 h时，可以观察到孢子发芽后菌丝较出发菌株更长，继续摇瓶培养至24 h时，突变株1的菌丝球量明显高于出发菌株，说明其对营养成分的利用更迅速，生长速度快于出发菌株，见图4。

图4 出发菌株与突变株1的菌丝照片

出发菌株和突变株1的生长曲线见图5。

图5 出发菌株与突变株1的生长曲线

由图5可知，突变株1的对数期较短，孢子接种后42 h菌体量达到最大值，较出发菌株提前5 h达到稳定期。

2.3 高转化率菌株的分离

将突变株1进行平板分离纯化，挑选10株进行摇瓶转化实验，结果如表1所示。

表1 突变株1分离纯化菌株转化性能

由表1可知，其转化率均高于55%，其中突变株50A-8的转化率达到62.7%。

2.4 突变株的稳定性实验

对转化性能最好的突变菌株50A-8连续传代，考察其遗传稳定性。结果表明，该菌株的遗传性能比较稳定。传代至第8代时，转化率为61.4%，第9代为61.2%。

3 结论

雷斯青霉孢子经N+离子注入技术诱变后，其存活率呈典型的“马鞍型”曲线，最适N+注入剂量为50×1014ions·cm-2，在该剂量下呈现出不同的菌落形态，从其中菌丝生长旺盛、孢子量较大的菌落中筛选到一高转化率突变株50A-8，该突变株对左旋乙基甾烯双酮的转化率可达62.7%，为出发菌株的1.16倍，且遗传稳定性良好。

参考文献：

[1] 余增亮．离子束与生命科学一个新的研究领域[J]．物理，1997，26(6)：333-338．

[2] 袁成凌，余增亮．低能离子束在生物技术中的应用研究[J]．中国生物工程杂志，2003，23(4):57-61.

[3] 陈宇，林梓鑫，张峰，等．离子注入微生物的生物效应研究[J]．中国抗生素杂志，1998，23(6)：415-419．

[4] Schlosser D，Irrgang S,Schmauder H P.Steroid hydroxylation with free and immobilized cells ofPenicilliumraistrickiiin the presence ofβ-cyclodextrin[J]．Applied Microbiology and Biotechnology,1993，39(1):16-20．

[5] Irrgang Sylke，Schlosser Dietmar,Fritsche Wolfgang．Involvement of cytochrome P-450 in the 15α-hydroxylation of 13-ethyl-gon-4-ene-3，17-dione byPenicilliumraistrickii[J]．Steroid Biochem Mol Biol,1997，60(5):339-346．

[6] Irrgang S，Schlosser D,Schmauder H P．The steroid 15α-hydroxylase ofPenicilliumraistrickiiI 477 is inducible[J]．Biotechnology Letters，1992，14(1):33-38．

[7] Schlosser D，Irrgang S，Schmauder H P．Morphological characterization of microenc apsulatedPenicilliumraistrickii477[J]．Acta Biotechnologica，1993，13(2):123-129．