高速逆流色谱法纯化丹酚酸B工艺研究

中药丹参[1]的化学成分主要分为两类:脂溶性二萜醌类和水溶性酚酸类[2]。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是丹参主要的水溶性成分，具有明显的抗氧化[3]、放松血管[4]、保肝护肝[5]的作用，其结构式见图1。

图1 丹酚酸B的结构式

高速逆流色谱法是由Ito[6]于20世纪80年代研发的一种新型液液分配技术。该技术无需固体载体，消除了样品的不可逆吸附，且具有分离度高、重现性好、分离量大等优势，广泛应用于天然植物的分离[7]。作者针对丹酚酸B极性大的特点，运用高速逆流色谱法对其进行了分离纯化。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

丹参购于武汉百姓大药房，经中科院武汉植物园李建强鉴定为丹参根茎。

所用试剂均为分析纯，天津富宇精细化工有限公司；双蒸水，自制。

FastChromeTM分析型高速逆流色谱仪、CXTH-3000色谱工作站、CF-30恒流泵，江阴逆流科技有限公司； 分离柱管直径1.70 mm，柱体积26.0 mL，进样环1.0 mL；UV-3000型紫外检测器，北京创新通恒科技有限公司；日立液相色谱仪(Hitachi Pump L-2130，Hitachi Autosampler L-2200，Hitachi Column Oven L-2300，Hitachi Diode Array Detector L-2455)；D-2000 Elite 工作站。

HPLC色谱条件：色谱柱：Fortis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：A为甲醇∶乙酸乙酯=4∶1(体积比)，B为0.2%甲酸水溶液，A∶B=40∶60(体积比)；流速1 mL·min-1，温度28℃，检测波长280 nm，进样量50 μL。

1.2 丹酚酸B部位的制备

取丹参切片100 g，粉碎，过200目筛，用70%乙醇溶液超声提取至无色。合并回收液，于60℃真空回收，制得粗浸膏。将粗浸膏过大孔树脂柱，流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液，共收集7段，其中第2段为丹酚酸B部位，用于后续实验。

1.3 高速逆流溶剂系统选择

按一定的比例配制溶剂系统，充分振荡，测定稳定时间，取相同体积的上下相溶液，加入一定量的样品，充分振荡混合，系统稳定后，分别取上下层溶液用HPLC进行含量分析，测定K值。

1.4 纯化工艺条件的确定

影响高速逆流系统分离效果的主要参数为流动相的流速、仪器的转速以及分离的温度。以保留率和稳定时间为考核指标，通过单因素实验确定最佳参数。

2 结果与讨论

2.1 溶剂系统的确定

溶剂系统的正确选择是实验成功的关键因素，合适的两相系统应该遵循以下原则[8]：

(1)具有一定的固定相保留率，一般溶剂的保留率应大于30%；

(2)两相在剧烈振动后，分层稳定时间应小于30 s；

(3)目标产物的K值应该在0.5与2之间；

(4)为了节约溶剂，要求上下两相有相近的体积。

根据各种溶剂的粘度、密度、极性等因素，测定了一系列溶剂系统的上下相体积比、稳定时间及K值，结果见表1。

表1 不同溶剂系统比较

由表1可知，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(1.0∶6.0∶1.5∶8.0∶0.1)的K值较适合丹酚酸B的分离，因此选择此溶剂系统为分离的最佳系统。

2.2 纯化工艺条件的优化(表2)

表2 工艺条件对保留率和稳定时间的影响

从表2可知，在转速与温度(仪器转速为1800 r·min-1、温度为30℃)一定的条件下，流动相流速越大，保留率越低，稳定时间越短。在流动相流速与温度(流动相流速为0.5 mL·min-1，温度为30℃)一定的情况下，转速越低，保留率越小，稳定时间越长。在转速与流动相流速(仪器转速为1800 r·min-1、流动相流速为0.5 mL·min-1)一定的情况下，温度越高，保留率越高，但对稳定时间几乎没有影响。

综合考虑保留率以及稳定时间，确定最佳工艺条件为：转速1800 r·min-1，流动相流速1.0 mL·min-1，温度30℃。

2.3 丹酚酸B的分离纯化及HPLC分析

将丹酚酸B部位进行HPLC分析，色谱图见图2a。由图2a可知第24 min峰为丹酚酸B，且为最大峰，表明此部位中含多种丹酚酸及鞣质，丹酚酸B含量最高。

运用高速逆流色谱对丹酚酸B部位进行分离，分离色谱见图3，第48 min峰为丹酚酸B，收集丹酚酸B，冷冻干燥。用HPLC分析，其色谱图见图2b。由图2b可知，第24 min峰为丹酚酸B，根据面积归一法计算丹酚酸B的纯度为98.3%。

图2 丹酚酸B部位(a)和纯化后丹酚酸B(b)HPLC分析

图3 丹酚酸B高速逆流分离色谱图

3 结论

运用高速逆流色谱法分离了丹参的活性成分丹酚酸B，其纯度达到98.3%，表明运用高速逆流色谱法能有效纯化丹酚酸B，且该方法与传统柱层析方法相比，具有不可逆吸附、无样品损失、成本低、方便、快捷等优点，可用于丹酚酸B的制备。

参考文献：

[1] 王举涛，彭代银，刘金旗，等.不同产地丹参中丹参酮ⅡA的含量比较[J].中国实验方剂学杂志，2008,14(3)：4-5.

[2] 余世春,琚小龙，段广勋.丹参的化学成分和药理活性研究概况(综述)[J].安徽卫生职业技术学院学报,2002，(2)：43-47.

[3] Liu C S,Chen N H,Zheng J T.Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced cytotoxicity by salvianolic acid B,a new compound isolated from RadixSalviaemiltiorrhizae[J].Phytomedicine,2007,14(7-8):492-497.

[4] Lam Francis F Y,Yeung John H K,Kwan Yiu W,et al.Salvianolic acid B,an aqueous component of danshen (Salviamiltiorrhiza),relaxes rat coronary artery by inhibition of calcium channels[J].European Journal of Pharmacology,2006,553(1-3):240-245.

[5] Lin Y L,Wu C H,Luo M H,et al.Invitroprotective effects of salvianolic acid B on primary hepatocytes and hepatic stellate cells[J].Journal of Ethnopharmacology,2006,105(1-2):215-222.

[6] Ito Y.Countercurrent Chromatography Theory & Practice[M].NewYork:Marcel Dekker Inc,1988:252-360.

[7] 戴德舜,王义明，罗国安.高速逆流色谱研究进展[J].分析化学，2001，29(5):586-591.

[8] Marston A,Hostettmann K.Developments in the appliacation of counter-current chromatography to plant analysis[J].J Chromatogr A，2006,1112(1-2):181-194.