新型水蛭肽嵌合蛋白治疗脑出血后脑水肿的实验研究

杨 辉，周远大，何海霞

（1.重庆医科大学附属第一医院药剂科，重庆 400016； 2.重庆医科大学附属第一医院临床药理教研室，重庆 400016）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）的发病率、病死率、致残率均较高，严重威胁人类健康和生命[1]。原发性脑出血时，出血后血肿的占位效应及分解产物会导致周围脑组织脑血流下降、继发性脑水肿、颅内压增高等连锁反应，使病情恶化。水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）是采用基因工程技术构建的双功能嵌合蛋白，由重组中性粒细胞抑制因子（neutrophil inhibltory factor）、纤维蛋白的结合肽和水蛭素活性肽段嵌合，具有中性粒细胞抑制因子的功能和凝血酶的活性，由重庆富进生物医药公司采用大肠杆菌表达系统制备而成。TNHH对大鼠动脉阻塞性脑缺血损伤有明显的保护作用[2]。本试验采用TNHH对脑出血大鼠进行治疗，观察脑出血后大鼠脑含水量、神经功能损伤与髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）之间的关系以及TNHH治疗的效果，探讨其治疗作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：健康合格清洁级SD大鼠96只，雄性，体重180～230 g，由重庆医科大学试验动物中心提供。

仪器：动物立体定位仪（上海第二军医大学）；BP61型电子分析天平（德国Sartorius）；VXH-3型微型漩涡混合器（上海跃进医疗器械厂）；低温医用冰箱（日本SANYO）；Uvimini-1240型紫外分光光度计（日本SHIMADZU）；微量注射器（宁波市三爱仪器厂）；红外恒温干燥箱（上海跃进器械厂）。

主要试剂与药品：注射用TNHH，由重庆富进生物医药公司提供，系冻干制剂，规格为 3 mg/支，纯度大于 95%，批号为20050401；部分凝血活酶活性时间（APTT）试剂盒，购自上海太阳生物技术公司；MPO测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药

将96只大鼠随机分为假手术组（A组）、脑出血模型组（B组）、TNHH组（C组），每组32只，A组只进针不注血。A组和B组静脉注射等容量生理盐水，C组静脉注射TNHH 2 mg/kg。分别于造模前30 min及造模后每12 h给药1次，于6，24，72，168 h时分别用Longa标准[3]测定神经功能缺损。各组大鼠在处死前进行神经功能缺损评分，0级为无体征，记0分；Ⅰ级为动物不能完全伸直其前肢，记1分；Ⅱ级为动物一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分；Ⅲ级为动物不能站立、打滚，记3分；Ⅳ级为无自发性活动，有意识障碍，记4分。评分在1～4分之间且取脑时可见脑内血肿形成的大鼠入选实验组，表明脑出血模型制作成功。

1.2.2 模型制备

参照改良的自体尾动脉血两次注血法制作脑出血模型[4]。术后用医用骨蜡封闭骨孔，缝合头部皮肤，整个过程采用无菌操作。大鼠清醒后无偏瘫体征（Longa评分）或血液沿针道反流者弃用。A组操作与制作模型步骤相同，但不注血。

1.2.3 测定指标及方法

脑含水量（干湿重法）：各时间点每组动物处死后迅速取出全脑，置冰台上，去除小脑和脑干。从进针点将大脑冠状位切成前后两部分，前部脑组织留做HE染色，后部脑组织再从矢状缝切开成左右两半，分别称其湿重后，置100℃恒温干燥箱24 h后称其干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

MPO：各组大鼠分别于不同时相点断头取脑，用4℃的冰盐水冲洗干净脑表面的血液，后用滤纸吸干净，以进针点作冠状切面，取血肿周围新鲜脑组织200 mg，按照1∶9的比例加入磷酸盐缓冲液（PBS），冰浴下匀浆，4℃ 条件下3 000 r/min离心15 min后，取上清液，即为待检样品。测定MPO活性，具体操作按试剂盒说明书进行。

APTT：在不同时相点Longa评分后，经颈动脉取血1.8 mL，迅速加入盛有0.2 mL的0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝液的硅化玻璃管中，轻轻颠倒混匀，3 000 r/min离心15 min，收集上层液体，测定APTT，以判断TNHH对凝血功能的影响。

HE染色：将脑水肿测量剩余的进针点前部脑组织用甲醛固定后石蜡包埋，切取片厚5 mm，常规HE染色，观察水肿细胞形态及炎症细胞浸润等情况。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS统计软件包进行数据分析，各组数据以均数±标准差表示，两两比较用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HE染色：光学显微镜下观察，A组大鼠大脑各部分细胞排列整齐，形态结构完整，基质无水肿，无炎性细胞浸润；B组血肿周围神经元数目明显减少，排列紊乱，基质水肿明显，细胞形态不完整，有大量炎性细胞及肥大变形的胶质细胞浸润；C组与同时相点B组比较，血肿周围水肿带及炎症细胞浸润等均有不同程度的改善。

神经功能缺损评分：结果见表1。B组大鼠神经功能缺损在24 h时最明显，各个时相点显著高于A组；C组大鼠各个时相点神经功能缺损均显著低于B组，但仍高于A组。

脑含水量：结果见表1。B组大鼠脑含水量从6 h开始逐渐增多，72 h达高峰，与A组大鼠相比有显著性差异，168 h时差异则不显著；C组大鼠从6～72 h脑含水量与B组相比均显著下降，168 h时差异则不显著（P＞0.05），与A组比较无显著性差异。

表1 各组大鼠不同时间观察指标比较（±s）

表1 各组大鼠不同时间观察指标比较（±s）

注：与 A 组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与 B组比较，□P＜0.05，■P＜0.01。

时间（h）神经功能缺损评分（分） 脑含水量（%） 脑匀浆MPO（MPO单位/g湿片） 血清APTT（s）A组B组B组C组C组A组B组C组A组B组C组6 24 72 168 A组 0 0 0 0 1.750±0.707 2.750±0.707 2.375±6.744 1.375±0.518 1.125±0.354□1.625±0.744■1.652±0.518□0.875±0.354□76.72±0.73■76.68±0.64■78.85±0.82■73.32±1.79 78.83±1.08▲79.78±1.30▲79.14±1.76▲77.72±2.02 77.57 ±0.85△□77.80±2.15△77.74±0.64△76.52±0.88 0.049±0.011□0.049±0.011■0.049±0.011■0.049±0.011 0.083±0.021△0.086±0.015▲0.089±0.007▲0.065±0.013 0.050±0.012□0.054±0.011■0.054±0.011■0.051±0.015 20.71±2.75□19.71±2.75■19.71±2.75■19.71±2.75 18.00±1.15△17.00±1.29▲16.29±1.51▲20.14±2.79 19.86±3.13 19.43±2.88 19.29±2.87□19.86±3.13

脑匀浆MPO：结果见表1。B组大鼠脑匀浆MPO从6 h开始逐渐增多，72 h达高峰，与A组大鼠相比有显著性差异，168 h时差异则不显著；C组大鼠从6～72 h脑匀浆MPO与B组相比均显著下降，168 h时差异则不显著，与A组比较无显著性差异。

血清APTT：结果见表1。B组大鼠血清APTT值从6 h开始逐渐缩短，72 h时最明显，与A组大鼠相比有显著性差异，168 h时差异则不显著；C组大鼠血清APTT测定仅在72 h时与B组相比有显著性差异，其余各观察时间点与B组、A相比差异均不显著。

3 讨论

对于脑出血，目前临床尚缺乏有效的防治手段，因此对出血性脑损伤的病理生理机制研究显得尤为重要。本研究参照改良的自体尾动脉血两次注血法制作脑出血模型[4]，术后脑出血模型组大鼠均出现神经功能缺损体征，脑含水量明显增加，表明大鼠脑出血模型是成功的。

既往研究表明[5]，出血后脑损伤有多种机制，如凝血酶的毒性、血肿周围水肿带及炎症细胞浸润、血肿分解产物、继发性颅内高压等，其中前两者尤为重要。凝血酶作为一种细胞外信号分子，介导神经毒性作用是通过其受体实现的[6]。急性脑出血后血液凝固过程中可释放大量凝血酶，直接渗透或缓慢释放到组织间隙，作用于局部神经胶质细胞、神经元和血管内皮细胞膜上凝血酶受体，促进细胞内信号转导，诱导多种炎性细胞因子的表达，而这些炎性细胞因子促进白细胞黏附于血管内皮细胞或神经细胞，从而加重炎性损伤。

中性粒细胞抑制因子可减少血肿周围水肿带中性粒细胞的积聚、渗出，减轻中性粒细胞介导的炎性反应和减少微血栓的形成，防止液体从血脑屏障渗出，从而有效减轻脑水肿，减轻神经功能的损害[7]。水蛭素是凝血酶特异抑制剂，可直接减轻凝血酶的神经毒性。本研究显示，TNHH可明显改善脑出血大鼠神经功能缺损体征，减轻脑出血后脑含水量和病理损害，降低急性脑出血后血肿周围组织白细胞特征性成分MPO的活性，与脑出血模型组相比有显著性差异（P＜0.01或 P＜0.05）。可见，TNHH能明显减轻脑出血后脑水肿，值得进一步开发。

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