两种根管冲洗方法联合不同冲洗液对粪肠球菌作用的体外研究

陈建洪 李玲 唐倩 陆超云 黄娴娴

根管内感染物质的存在是影响根管治疗质量的重要因素之一。因此，如何有效去除根管内的感染物质是成功的重要前提。根管冲洗液通过机械冲刷作用以及化学溶解作用，配合有效的根管预备，可将大部分的感染物质去除。研究［1，2］证明，不同的根管冲洗方法与冲洗液对去除感染物质的效果不尽相同。

粪肠球菌(E.faecalis)常可在慢性持续性根尖周损害或再次治疗的根管中检测出，是根管治疗的顽固菌。研究发现［3］，这与粪肠球菌可进入牙本质小管，同时对营养缺乏的环境有极大耐受力有显著关系。因此，如何最大程度的去除牙本质小管内的粪肠球菌对治疗结果有很大影响。次氯酸钠是对粪肠球菌效果较好的冲洗液［4］，然而较高浓度对根尖周组织的刺激性较大。超声根管冲洗是近年来普遍应用于口腔临床的冲洗方法，与人工注射器冲洗相比，其有效性已经越来越得到肯定［1］。另外，粪肠球菌是相对容易培养的细菌，利用粪肠球菌的体外根管感染模型来检测药物的抗菌作用已经得到了许多学者的赞同［5］。本实验研究目的旨在通过培养体外粪肠球菌的感染模型，来观察超声根管冲洗以及17%EDTA与不同浓度的次氯酸钠冲洗液组合对粪肠球菌的清除效果。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2009年6月至2010年1月在中山大学附属第三医院口腔科因正畸需要减数拔牙的健康单根前磨牙58例，患者年龄:14～22岁。纳入标准:单直通畅根管，根尖孔均发育完全，无近髓龋坏或近髓充填体，未做过牙髓治疗，无根尖吸收、根裂等其他缺陷。

1.2 离体牙预备 将实验牙去除根周软组织、牙石等，清洗干净后置于生理盐水中4℃冰箱保存备用。切除牙冠，保留牙根长度为15mm。常规消毒拔髓，采用Protaper器械冠向下法进行根管预备，首先用镍钛扩孔钻敞开根管口，按照S1、S2、F1、F2、F3的顺序进行根管预备至 30#(04 锥度)，根管预备过程中每换一次器械用0.9%NaCl2ml匀速冲洗，时间为1min。预备完毕后，根尖孔及以上2mm区域用环氧树脂(日本株式会社)封闭。高温高压消毒30min备用。随机选取2个标本置于装有5ml新鲜配制的无菌牛心脑浸液(brain heartinfusionbroth，BHI，Sigma 公司)培养液的试管内，每天更换新鲜培养液，通过分光光度计检测A值观察培养液浑浊度以确定消毒效果。

1.3 感染模型的建立 将保存于-70℃冰箱中的粪肠球菌(标准株ATCC29212)解冻复苏后，接种于新鲜配制的BHI培养基中，37℃厌氧条件下培养24h。用生理盐水稀释，使菌液密度为3×108CFU/ml，与麦氏比浊管一致。将配制好的菌液以200UL/根管接种到56颗离体牙中，10min内操作完毕。将标本放于盛有BHI培养基的24孔板中，37℃下CO2孵育箱中孵育培养21d，隔日更换一次新鲜培养菌液。并随机抽取任一标本菌液进行微生物检测，根据菌落形态、革兰染色、触酶试验，确定无杂菌污染后则继续实验，若发现污染，则实验立即终止。

1.4 实验分组:按照随机数字表分别采用超声根管冲洗法以及人工注射器冲洗法进行根管冲洗，每组根据冲洗液的不同分为四小组，分别为17%EDTA+1%NaClO(A组)、17%EDTA+2.5%NaClO(B 组)、5.25%NaClO(C 组)、0.9%NaCl(D组 阳性对照组)，每组7个标本。

1.5 感染模型的取样及细菌培养计数

1.5.1 第一次取样(N1) 根管冲洗前用30#无菌纸尖按照工作长度插入根管中停留1min，吸取根管内液，立即放入装有1ml生理盐水的Eppendorf管中混匀，分别接种于BHI血琼脂平皿上，37℃下CO2孵育箱中培养，48h后计数菌落数(CFU/ml)，记为样本 N1。

1.5.2 第二次取样(N2) 手动不锈钢K锉继续预备根管中下段至50#，每更换一次器械时分别以A、B、C、D组液配以两种冲洗方法进行根管冲洗，详见1.6。最后用2ml无菌生理盐水冲洗根管，以避免冲洗液的过度作用。立即用30#无菌纸尖按照根管长度插入根管中停留1min，吸取根管内液送培养计数，记为样本N2。

1.6 冲洗方法 超声根管冲洗组:在超声治疗仪(法国赛特力公司)上用30号超声根管锉按照根管长度放入根管，后退2mm，不做旋转及提拉动作，尽量避免接触根管壁，4ml各组冲洗液(A、B组 EDTA、NaClO各2ml)超声振动冲洗1min;人工注射器冲洗组:使用5ml注射器针管和1ml侧向开口的注射器针头，冲洗时将注射器针头沿根管侧壁放入根管深部，达工作长度后后退2mm，以无阻力，不嵌塞，回流通畅为准，并不时上下，左右移动针头，4ml各组冲洗液(A、B组 EDTA、NaClO各2ml)匀速缓慢冲洗，速度为4ml/min。

1.7 细菌菌落计数 用取样枪取Eppendorf管中液体0.5 ml，10倍系列稀释，接种于BHI培养基，37℃厌氧培养48h之后计数菌落形成单位(CFU)。

1.8 细菌复苏实验 第二次取样后，在根管内分别插入四根饱含BHI液体培养基的纸尖，37℃下CO2孵育箱中培养72h后夹出纸尖放入BHI液体培养基中，继续培养48h，肉眼见培养基变浑浊并根据菌落形态、革兰染色实验以及触媒实验来确定是否有其他微生物感染。

1.9 统计学分析 将细菌计数结果按lg(CFU/ml)做对数转换，利用方差分析做统计学处理。见表1。

表1 两种冲洗方法及不同冲洗液对粪肠球菌的作用

2 结果

通过单因素分析方差分析(One-wayANOVA)，无论在超声根管冲洗组或是在人工注射器冲洗组，A、B、C、D四组中的粪肠球菌量在冲洗前均无显著差异(超声组F=1.7758，P=0.1786＞0.05;人工组 F=1.2748，P=0.3054＞0.05)。而各组冲洗后的细菌量与冲洗前均存在显著差异(超声组F=168.7702P=0.0000 ＜0.05;人工组 F=180.5105，P=0.0000＜0.05)。其中，A、B、C三组冲洗液与阳性对照组D组相比，均存在显著性差异(P＜0.05)，见表2。同时，A、B、C三组的差值两两比较，B组与 A、C组均存在显著差异(P＜0.05)，而A、C组之间无显著差异(P＞0.05)，见表3。将超声根管冲洗与人工注射器冲洗相比较，发现在A组与C组中，两种方法存在显著的差异，前者明显优于后者。而在B组中，两者无显著差异，见表4。细菌复苏实验发现培养液变浑浊。

表2 A、B、C三组冲洗液与D组统计学比较

表3 A、B、C三组冲洗液两两对照

表4 两种冲洗方法在不同冲洗液组中的差值

3 讨论

粪肠球菌是呼吸道及肠道中的常驻菌之一，在口腔也常可检测到，是一种重要的条件致病菌。它与久治不愈的慢性根尖周损害或经再次治疗的根管感染有显著关系，经PCR检测，可达到70%左右［6］，由于其治疗的复杂性，已越来越成为研究的热点。

关于粪肠球菌的致病机制尚未完全明了，主要与以下几个方面有关［7］:①粪肠球菌形态多样，体积小，可进入牙本质小管内，同时其分泌的丝氨酸蛋白酶、明胶酶、胶原凝结蛋白可促进与牙本质进一步结合;②粪肠球菌可以延长自身的生存周期，使分裂繁殖基本处于静止状态，来对抗营养缺乏的外界环境，一旦有足够的营养物质，饥饿细胞可迅速恢复活性;③粪肠球菌可以抑制多形核中性粒细胞向下调节α4细胞黏附分子的表达水平，导致多形核中性粒细胞无法针对粪肠球菌发挥作用;④在高pH值条件下仍可存活;⑤粪肠球菌与其他细菌细胞竞争形成的生物膜对其自身具有很好的保护作用;有研究表明，粪肠球菌所形成的生物膜使粪肠球菌耐受吞噬作用.抗原抗体反应以及抗菌剂的能力比无生物膜的细菌高出一千倍。另外，粪肠球菌生物膜常存在于根管的中下段、狭窄区及死区，物理性的器械预备及根管冲洗难以完全消除感染物质，这对于其治疗增加了难度。

理想的根管消毒药物应满足以下条件［8］:①较强的抗菌效果;②有效溶解有机组织;③去除根管涂层;④对根尖周组织无毒性。目前，尚无一种理想的消毒药物能完全杀灭粪肠球菌。樟脑氯酚虽然杀菌效果较强，然而以其为代表的苯酚类药物由于可能具有致畸、致突变的副作用，已不推荐使用;同时临床上经常使用的消毒药物氢氧化钙已经证明了对其效果不佳［9］;近年来，有关实验［10］认为中药制剂五倍子水提取物对粪肠球菌的杀菌效果较好，同时其毒副作用小，不易产生耐药性，但是关于其确切疗效尚在进一步研究中。

次氯酸钠经研究证明对粪肠球菌具有很好的疗效［11］，同时可以溶解有机残髓。但是由于不能有效去除玷污层，其表面张力亦同时抑制了进入牙本质小管的能力。而EDTA可与金属钙离子形成易溶的螯合物，软化根管牙本质，达到脱矿消除玷污层及牙本质碎屑的效果，两者联合应用，可达到相互补偿相互增效的作用［12］。本文分别选择17%EDTA+1%Na-ClO、17%EDTA+2.5%NaClO、5.25%NaClO 与生理盐水做对照，发现三者抑制粪肠球菌的能力均明显高于对照组，说明次氯酸钠对粪肠球菌具有较好的作用。三组冲洗液对比研究中发现，17%EDTA+2.5%NaClO组明显优于其他两组，这与刘漪等［13］的实验结果相类似。而17%EDTA+1%NaClO与5.25%NaClO效果无明显差异，证明EDTA与NaClO联合应用，其效果优于单独用 NaClO来进行根管冲洗。研究证明［14］，次氯酸钠的杀菌效果随着浓度的升高而增强。而其细胞毒性亦与浓度成正比，高浓度的次氯酸钠可造成根尖周组织剧烈的疼痛、肿胀和出血。考虑到抑菌和根尖周组织反应的双重效应，从本文试验结果看，17%EDTA+2.5%NaClO为推荐使用的冲洗组合。

与传统的人工注射器冲洗方法相比，超声根管冲洗通过超声的热效应、声流效应和“空穴效应”来作用于根管，尤其是加上“超声协同系统”大量的液体交换，可使冲洗液中有效的杀菌成份得到补充，从而获得高效的冲洗和清理效果。本实验A、C两组中，两种冲洗方法后的粪肠球菌量比较有明显统计学意义，说明超声根管冲洗对清除粪肠球菌有明显效果，这可能与超声声流效应，能够有效地溶解和松解根管内的坏死组织，使侧副根管和牙本质小管内的细菌进入主根管，彻底清除附着在根管壁上的污染层有关［1］。同时由于粪肠球菌生物膜位于根管中下段、死区、狭窄区，普通的人工注射器冲洗难以到达，因此减弱了对粪肠球菌的抑制作用。而B组中，两种冲洗方法无显著性差异，这可能与17%EDTA+2.5%NaClO本身的抑菌效果较强，冲洗后菌量较少而无统计学意义有关。

本文实验结果还发现，在阳性对照组D组中，冲洗后与冲洗前的细菌量相比亦有统计学意义。说明根管预备对于去除粪肠球菌也有一定的效果。由于粪肠球菌一般位于根管中下段，因此在常规根管预备后，需继续扩大根管中下段以清除进入牙本质小管中的粪肠球菌。而细菌培养实验发现培养液变浑浊，证明根管清理后仍然有细菌的存在，说明上述根管预备方法配合冲洗液尚不能完全去除粪肠球菌。

综上所述，次氯酸钠对于粪肠球菌具有一定的抑菌效果，而联合EDTA使用，优越性更加显著。本文实验结果推荐使用17%EDTA+2.5%NaClO作为清除粪肠球菌的根管冲洗液。另外，相对于人工注射器冲洗而言，超声根管冲洗去除粪肠球菌的能力更明显。因此对于难治性的感染根管或再治疗的根管而言，推荐使用超声根管冲洗以取得比较好的疗效。

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