林蛙卵油灌胃对于雄激素预处理大鼠妇科内分泌的影响

苑春莉,孙连坤,康劲松

(1.吉林大学第一医院 妇产科,吉林 长春130021;2.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室,吉林 长春130021)

近年来的研究显示由取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油能调节妇科内分泌功能[1-3],本研究旨在通过动物实验分析林蛙卵油对于紊乱的妇科内分泌系统的调节作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 林蛙卵精油的提取

1.1.1 样品采集 吉林省桦甸产成龄林蛙,当年初冬捕获,在剥取林蛙油的同时取林蛙卵巢。

1.1.2 卵油的提取与精制 将林蛙卵巢自然晾干,除去杂质,用乙醇冷浸3次,过滤得卵渣,并减压回收乙醇,再过滤除去少量沉淀物,又得浅黄棕色液体粗卵油。将卵渣再反复用乙醇浸泡,直至乙醇液基本无色,倾出乙醇,并干燥、粉碎。所得乙醇液仍在减压下回收乙醇,卵油并入粗卵油中。粗卵油中加入2倍量的乙醇稀释后,加入20%的中和剂(兼有脱水作用),搅拌均匀,放置1 h后过滤,减压回收乙醇,即得黄棕色液体精制卵油。

1.2 雄激素处理模型的复制

选择9日龄Wistar清洁雌性大鼠50只,其中模型组40只,丙酸睾丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射,建立丙酸睾丸酮诱导的大鼠模型;正常组10只,同期生理盐水皮下注射。

1.3 动物实验

1.3.1 分组 共计50只大鼠,分为5组,分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组,模型组和正常组,每组10只,前4组在造模成功后喂养110天至成年。模型组和正常组用生理盐水3 ml/day灌胃;林蛙卵油各剂量组应用林蛙卵油灌胃,剂量为1.0,0.4,0.1 g/day,用生理盐水稀释至3 ml,灌胃15天后处死大鼠。

1.3.2 观察 在给予灌胃前即开始阴道涂片观察阴道细胞的变化。处死前称重,留取动脉血,立即离心留取血清。子宫和卵巢称重。

1.4 免疫组织化学检测

雌二醇、FSH、孕酮放免试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司,严格按照试剂盒说明进行实验。

1.5 统计学方法

采用SPSS11.5软件进行统计学分析,各组检测指标用±s表示,以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 阴道脱落细胞改变

模型组阴道细胞涂片见到大量角化细胞,林蛙卵油灌胃后阴道细胞涂片见到有核上皮细胞,尤其在大剂量组见到的有核上皮细胞较多。说明给予林蛙卵油灌胃后大鼠表现出动情前期的变化,卵巢功能有恢复。

2.2 卵巢、子宫的大体观察

模型组卵巢苍白,表面可见少量的卵泡,且卵泡较小,亦可见极少量的黄体;子宫较小,色泽欠红润。正常组、林蛙卵油大、中、小剂量组大鼠卵巢色泽鲜红,卵泡数目明显多于模型组,卵泡明显增大,表面见较多黄体;子宫外观粗大发紫,子宫肌层明显增厚。

2.3 卵巢镜下观察

新鲜黄体为体积较大又富有血管的内分泌细胞团,是排卵后,卵泡壁连同血管一起向卵泡腔塌陷,腔内可见凝固的血块;成熟卵泡即大卵泡,体积较大,凸向卵巢表面,卵泡腔很大,有一明显卵丘,可见清晰卵细胞;其余为小卵泡。模型组可见大量原始卵泡,卵泡多呈囊性扩张,颗粒细胞层次减少至1-2层,排列松散,卵细胞消失,内含大量浆液性物质,生长卵泡数目较少,极少见黄体出现。而正常组可见各期卵泡及黄体组织,未见囊性卵泡。林蛙卵油大、中、小剂量组生长卵泡数目明显增多,可见成熟卵泡及黄体,卵泡未见明显的囊性扩张。

2.4 林蛙卵油对大鼠子宫、卵巢重量及与体重之比的影响

模型组子宫及卵巢重量明显低于正常组(P＜0.01),而林蛙卵油各剂量均可明显增加子宫及卵巢的重量(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高剂量组增加的最为明显(见表1)。模型组卵巢体重之比明显低于正常组(P＜0.05),而林蛙卵油各剂量均可明显增加卵巢体重之比(P＜0.001),尤其以林蛙卵油高剂量组增加的最为明显。而林蛙卵油各剂量组对子宫体重之比没有明显影响(见表2)。

表1 林蛙卵油对大鼠子宫及卵巢重量的影响

表2 林蛙卵油对大鼠子宫及卵巢与体重之比的影响

2.5 血清学实验结果

模型组大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量与正常对照组相比明显降低(P＜0.05),而林蛙卵油各剂量组均能明显提高大鼠体内FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中剂量对体内FSH含量增加最明显,而林蛙卵油大剂量对体内雌二醇含量增加最为明显,林蛙卵油各剂量组对体内孕酮含量的改变不明显(见表3)。

表3 林蛙卵油对大鼠血清中激素水平的影响

3 讨论

中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)取蛙油剩余的卵以及由卵提取的卵精油的保健价值很高。彭飞等的研究证实林蛙卵油具有温和的降低血脂,软化血管,抑制血小板聚集、改善血液流变学特征、抑制血脂沉积作用[3];又有一定的中枢抑制作用[4,5],林蛙卵油具有明显的增强机体抗脂质过氧化损伤,调节免疫的抗衰老的生物作用[6],没有明显毒副反应,适合患者的用药心理。

我们的研究发现:模型组阴道细胞涂片见到大量角化细胞,林蛙卵油灌胃后阴道细胞涂片见到有核上皮细胞,尤其在大剂量组见到的有核上皮细胞较多。说明给予林蛙卵油灌胃后大鼠表现出动情前期的变化,卵巢功能有恢复。

处死大鼠后称量大鼠体重、子宫重量和卵巢重量发现:模型组子宫及卵巢重量明显低于正常组,而林蛙卵油各剂量均可明显增加子宫及卵巢的重量,尤其以林蛙卵油高剂量组增加的最为明显。进一步观察卵巢、子宫的大体结构改变发现:模型组卵巢苍白,表面可见少量的卵泡,且卵泡较小,亦可见极少量的黄体;子宫较小,色泽欠红润。正常组、林蛙卵油大、中、小剂量组大鼠卵巢色泽鲜红,卵泡数目明显多于模型组,卵泡明显增大,表面见较多黄体;子宫外观粗大发紫,子宫肌层明显增厚。结合光学显微镜下的观察,正常组卵巢中可以观察到新鲜黄体、成熟卵泡(即大卵泡)和小卵泡,未见囊性卵泡。模型组可见大量原始卵泡,卵泡多呈囊性扩张,颗粒细胞层次减少至1-2层,排列松散,卵细胞消失,内含大量浆液性物质,生长卵泡数目较少,极少见黄体出现。林蛙卵油大、中、小剂量组生长卵泡数目较模型组明显增多,可见成熟卵泡及黄体,卵泡未见明显的囊性扩张。说明我们制做的雄激素模型可以表现出卵巢中卵泡囊状扩张、不排卵进而不孕的生物学行为,所以这种模型被作为不孕症或者多囊卵巢综合症的实验研究模型,在排卵功能上和形态学上代表了两种疾病的最关键的表型,给予初生大鼠大剂量雄激素可以使成年大鼠的卵巢损伤,表现在卵巢萎缩,生长卵泡数量减少和排卵功能的缺失。给予林蛙卵油灌胃后对于这种卵巢损伤有纠正作用,卵巢形态学上恢复正常卵巢的状态,黄体的出现说明排卵功能的恢复。

我们进一步研究了各组大鼠血清中的雌激素、促卵泡激素和孕酮的含量。发现模型组大鼠血清中FSH、雌二醇、孕酮的含量与正常对照组相比明显降低,而林蛙卵油各剂量组均能明显提高大鼠体内FSH、雌二醇的含量,其中林蛙卵油中剂量对体内FSH含量增加最明显,而林蛙卵油大剂量对体内雌二醇含量增加最为明显,林蛙卵油各剂量组对体内孕酮含量的改变不明显。这一结果可以用雌激素在下丘脑-垂体-卵巢轴中的反馈调节作用来解释:雌激素对于下丘脑分泌的GnRH和垂体分泌的促性腺激素(促卵泡激素FSH和促黄体激素LH)的合成和分泌具有反馈调节作用。小剂量雌激素对下丘脑产生负反馈,抑制GnRH的分泌,减少垂体的促性腺激素的分泌;大剂量雌激素既可以产生正反馈,又可以产生负反馈,排卵前大量产生的雌激素刺激下丘脑GnRH和垂体FSH、LH的大量释放,而排卵后血清中大量的雌激素与孕激素协同作用,FSH、LH的分泌又受到抑制。我们的实验结果充分说明,林蛙卵油对于卵巢的保护作用有效的作用成分可能是雌激素:初生期给予雄激素抑制了下丘脑-垂体-卵巢轴的发育,我们测定的多个激素(FSH、E、P)均处于低水平,而给予林蛙卵油灌胃后,补充了外源性雌激素,提高了血清中的雌激素水平,大剂量的雌激素对于下丘脑和垂体产生正反馈作用,刺激FSH水平升高,由于单纯的雌激素作用没有引致大量排卵,缺乏孕激素的协同作用,所以负反馈作用对于FSH分泌的抑制不明显。至于中剂量组较高剂量组FSH升高明显的机制,尚待对于林蛙卵油成分的进一步认识。

[1]王 宇,尚德静,冯伯森.中国林蛙蛙卵营养成分分析[J].辽宁师范大学学报(自然科学版),2004,27(4):471.

[2]杜景新,王 丽,李春慧,等.林蛙油、林蛙卵油的成分及开发利用[J].人参研究,2003,3:18.

[3]彭 飞,徐 峰,刘 彬,等.中国林蛙卵油对高脂血症大鼠降脂作用的观察[J].医学理论与实践,2003,16(9):996.

[4]彭 飞,徐 峰,赵 倩,等.中国林蛙卵油的抗惊厥作用及其与单胺神经递质的关系[J].中国药学杂志,2005,40(12):912.

[5]佟 岩,徐 峰,陈 侠,等.中国林蛙卵油的抗焦虑作用[J].沈阳药科大学学报,2004,21(1):41.

[6]金莉莉,刘德文,范文今,等.中国林蛙卵、卵油及输卵管对红细胞SOD活性的影响[J].中国公共卫生,2002,18(5):607.