IGF-1a的克隆与表达

贾赞慧,郑桂英,崔满华*,孙 琳,范艳艳

(1.吉林大学第二医院 妇产科,吉林长春130041;2.吉林大学化学系;3.吉林大学第一医院)

胰岛素样生长因子-1(IGF-1a)在多种肿瘤组织中均呈高表达状态,这种表达与肿瘤的分化程度、预后有关[1]。有学者研究发现,子宫内膜间质和腺上皮细胞合成和表达的IGF-1a参与子宫内膜的增生和分化以及淋巴转移[2]。在进行IGF-1a与子宫内膜癌发生发展关系研究过程中,需要提供大量IGF-1a蛋白质,本实验采用用分子克隆技术正确克隆及表达IGF-1a,为探讨其在子宫内膜癌发生、转移和治疗中的意义提供实验室基础,现将该基因的克隆、表达及纯化过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 NcoⅠ和 XhoⅠ内切酶购自TakaRa公司;Taq DNA 聚合酶 、dNTP、oligo-dT、10 ×PCR缓冲液、T4连接酶购自美国 Promega公司;RNase、卡那霉素及氨苄青霉素购于华美生物工程公司;IPTG购自Sigma公司。pET表达系统购自美国Novagen公司。pMD18-T vector购自TakaRa公司;大肠杆菌菌种BL21由本室保存。DNA marker购自华美生物工程公司,引物由上海生物工程公司合成。

1.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒的构建①IGF-1a基因的获取:用所合成的引物进行五重PCR扩增,五对引物为:第一对引物共设计5对引物,各对引物顺序均从 5'到3',第一对引物GCTCTTCACTTCGTGTGTCGACCGAGGGGCTTTTACTTC AACAAGCCCACAGGCTATG(58 bp)和CACTCATCCACAATCCCTGTCTGAGGTGCCCTCCGAATGCTGGAGCCA TAGCCTGTGG(58 bp);第二对引物CACTACAGCCGGACCAGAGACCCTTTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCT CTTCACTTC( 58 bp)和CACAGTACATCTCCAGTCTCCT CAGATCACAGCTCCGGAAGCAACACTCATCCACAATC-(58 bp);第三对引物为CACACCTGTTCTACCTGGCGTCTGCTTGCTCACCTTCACCAGCTCCACTACAGCCCGG(58 bp)和GTTGGGCACGGATAGAGCGGGCTGCTTTTGTAGGCTTCAGTGGGGCACAGTACATCTC(58 bp);第四对引物CTGCCTCTGTGACTTCTTGAAGATAAAGATACACATCATGTCGTCTTCACACCTGTTC(58 bp)和TTCAAATGTACTTCCTTCTGAGTCTTGGGCATGTCAGTGTGGCGTTGGGCACGGATAG (58 bp);第五对引物CCATGGGGAAAATCAGCAGCCTTCCAACTCAATTATTTAAGATCTGCCTCTGTGAC(56 bp)和CTCGAGCATTC-TGTAGGTCTTGTTTCCTGCACTTCCTCTACTTGTGTTCTTCAAATGTACTTC(63 bp)。②pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒的获得:将PCR扩增出的产物片段以NcoI和XhoI切点定向克隆入pET28a表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。取经卡那霉素平板筛选的阳性转化菌培养,提取质粒。采用相同酶切后,用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。然后由上海生物工程公司对重组质粒进行测序鉴定。

1.3 IGF-1a的表达和纯化 ①阳性重组克隆的筛选:将pET28a转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)涂于含卡那霉素的LB平板上。分别挑取单克隆,加人适量的LB培养液,37℃培养过夜,用碱裂解法制备质粒,pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒用NcoI和XhoI双酶切及2%琼脂糖凝胶电泳对阳性克隆进行鉴定,释放出长度约为481 bp的片段的菌落为阳性重组克隆。利用载体多克隆位点的上游序列设计测序引物,由本室AB1310DNA序列自动分析仪进行测序鉴定。②表达:挑取含pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒的单菌落,生长于含有50 g/L卡那霉素的LB培养基中。菌液在三角烧瓶中于37℃、200 r/min的恒温摇床上震荡培养至A600值为0.5-1.0,然后用0.1%IPTG于37℃诱导3 h。离心收集菌体进行SDSPAGE分析,在相对分子质量约15 kd的位置上有明显表达条带的为阳性克隆。③表达产物的纯化:离心收获大肠杆菌并将其悬于含2 mmol/L PMSF的溶液中,超声破碎裂菌。将细菌裂解液装人镍离子鳌合琼脂糖凝胶-4B柱上。层析柱用1%Tritonx-100充分洗涤以去除内毒素,被结合的蛋白质用50 mmol/L的咪唑洗脱,然后用Q-琼脂糖凝胶柱进一步纯化,贮存于-70℃。通过SD-SPAGE和凝胶扫描仪分析纯度。

2 结果

2.1 IGF-1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

第1个PCR应合成104 bp片段,第2个PCR应合成194 bp片段,第3个PCR应合成285 bp片段,第4个PCR应合成378 bp片段,第5个PCR应合成481 bp片段,5次PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果与实际碱基对数相符,见图1。

2.2 pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒NcoⅠ和XhoⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳

在1 000-2 000 bp可见一条明亮电泳带,与实际碱基对数(467 bp)相符,见图2。上海生物工程公司测序结果表明,重组质粒中IGF-1碱基序列正确。

2.3 IGF-1蛋白表达纯化产物SDS-PAGE

重组蛋白的表达量可以达到菌体蛋白的60%以上;纯化后重组蛋白的纯度可达 98%以上,见图3。

图1 IGF-1 5重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 2%琼脂糖凝胶电泳分析

图3 IGF-1a蛋白表达纯化产物图

3 讨论

近年来IGF-1a在基础研究和临床应用上的重要性倍受关注。国内外有多家实验室开展了重组IGF-1a的研制工作,所用的克隆方法及表达系统也各不相同,既有大肠杆菌原核表达系统,也有酵母或哺乳动物细胞等真核表达系统[3,4]

本研究通过多重PCR方法成功克隆了IGF-1a目的基因,并构建了pET28a-Cpn10-IGF-1a重组质粒,实现了外源蛋白在大肠杆菌中的诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表明,该外源蛋白是IGF-1a基因的表达产物,并且通过镍金属鳌合亲和层析,获得了高纯度的目的蛋白。

多重PCR(multiplex PCR)是在同一试管中加入多对引物,扩增同一模板的几个区域,可一次性筛选出目的DNA,具有检测的覆盖面较广、效率较高、费用相对较低等优点[5],本研究选用的大肠杆菌原核表达系统在基因表达技术中发展最早、应用最广泛,与其他系统相比具有遗传背景清楚、繁殖快、表达效率高及抗污染能力强[6],提高目的蛋白表达量,方便下游蛋白纯化等优点[7]。pET28a(+)原核表达载体含有能被T7 RNA聚合酶特异性识别的T7强启动子[8]。将外源基因置于T7启动子控制下,经IPTG诱导后能够高效表达外源蛋白。从图3可以看出,重组蛋白的表达量可以达到菌体蛋白总量的60%以上,重组蛋白的纯度可达98%以上,完全能满足下游实验的要求,从而为探索IGF-1与子宫内膜腺癌的发生发展及淋巴转移的相关性[2]研究奠定了实验基础。

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