嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响

李 昆,何海涛,李鸿梅,刘剑凯,洪 敏*

(1.吉林大学白求恩医学院生物化学教研室,吉林长春130021;2.吉林大学护理学院)

已有研究表明,吗啡、海洛因等阿片类物质可引起嘌呤核苷酸分解过度[1,2],而合成代谢降低[3,4]。可见,在长期使用阿片的过程中嘌呤核苷酸亏欠可能是造成药物依赖的机制之一。外源性补偿核苷酸对海洛因所致的嘌呤核苷酸代谢改变是否有改善作用目前尚无报道。本研究旨在探讨补偿嘌呤核苷酸对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 正常雄性Wistar大鼠,体重180-200 g,吉林大学医学实验动物中心提供(合格证号SCXK2006)。海洛因由吉林省公安厅提供,纯度为98%,用生理盐水配制后抽滤除菌。单磷酸腺苷(AMP)及单磷酸鸟苷(GMP)为Amersco产品。Trisol RNA提取试剂盒(Gibco公司)、PrimeScript RT Reagents Kit和SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TaKaRa公司)、实时荧光定量PCR仪(ABI Prism 7000型,USA)。

1.2 动物分组及处理 50只大鼠随机分为5组:①对照组:每日两次腹腔注射生理盐水,注射体积及时间与海洛因组相同,第10天处死。②海洛因组:建立海洛因依赖大鼠模型,第1-9天每日两次腹腔注射海洛因,每日次剂量依次为 0.50、0.75、1.25、2.00、3.00、4.25、5.75、5.75、5.75 mg·kg-1体重 。 ③海洛因+AMP+GMP组:海洛因给药同第2组,并且每日两次腹腔注射核苷酸(AMP与GMP等摩尔混合),每日次剂量均为 7.5 mg·kg-1体重。④海洛因+AMP组:海洛因给药同第2组,并且每日两次腹腔注射AMP,每日次剂量均为7.5 mg·kg-1体重。⑤海洛因+GMP组:海洛因给药同第2组,并且每日两次腹腔注射GMP,每日次剂量均为7.5mg·kg-1体重。各组大鼠于d 10麻醉、处死后,迅速取大脑皮质,立即放入液氮中2 h,然后转入到-86℃超低温冰箱内。

1.3 引设物计 所有引物(见表1)均用引物设计软件PrimerPrimer 5.0设计,由南京金斯特公司合成。

Table 1 Sequences of oligonucleotides used as primers

1.4 RNA抽提 根据Trisol RNA提取试剂盒的操作步骤提取大脑皮质总RNA,核酸测定仪测A260/A280,要求在1.8-2.0之间。逆转录反应获得的cDNA-20℃保存。

1.5 SYBR荧光实时定量PCR 参照说明书设定PCR程序;熔解曲线程序:95℃1 min,65℃15 s,65℃10 s,从65℃缓慢升温至95℃,每升高0.5℃检测一次荧光信号值。反应结束仪器自动生成Ct(threshold cycles)值及熔解曲线图。每个样本设3个重复管,同时设无模板阴性对照。

1.6 统计学分析 各靶基因mRNA相对表达量采用Pfaffl[5]法进行分析,将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减,所得出的Δ Ct为目的基因相对于内参基因的表达强度,即Δ Ct=目的基因Ct-内参基因Ct。再使用 2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示 ,-Δ Δ Ct=-(Δ Ct实验组 -Δ Ct对照组)。2-ΔΔCt＞1,目的基因表达上调,反之下调。数据用±s表示,各组均数之间比较采用SPSS11.0统计软件进行t检验。

2 结果

实时定量荧光PCR检测显示,海洛因组ADA、黄嘌呤氧化酶(XO)的mRNA比对照组明显升高,分别为对照组的3.3倍和2.7倍(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比明显降低(P＜0.05)。海洛因组次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)的mRNA比对照组明显降低,分别为对照组的18%,43%和33%(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比有不同程度升高,以HGPRT的升高程度尤为显著(P＜0.05)。海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组的各项指标差异无显著性,见图1。

3 讨论

图1 大鼠脑组织中APA、XO、AK、APRT、HGPRT相对表达水平

本实验采用SYBR Green I荧光实时定量RTPCR法检测ADA,XO,AK,APRT,HGPRT mRNA的表达,以探讨外源性补偿嘌呤核苷酸对海洛因所致的嘌呤核苷酸分解代谢增强、合成代谢减弱是否有改善作用。该方法在应用过程中需结合熔解曲线分析来确定PCR产物的特异性[6]。本实验通过熔解曲线分析,确定PCR反应特异性好,反应过程中荧光信号可反映扩增产物含量的实时变化。结果分析采用相对定量Pfaffl法,首先通过构建目的基因与内参基因β-actin的标准曲线对五种基因扩增效率进行检测,在此基础上,用β-actin对各组RNA作均一化处理,计算各实验组相对于空白对照组的各目的基因mRNA表达的差异倍数。

腺嘌呤核苷脱氨酶(ADA)和黄嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤核苷酸分解代谢的关键酶,ADA催化腺嘌呤核苷酸转化为次黄嘌呤核苷酸,进而分解成次黄嘌呤;XO催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤,再催化黄嘌呤分解为尿酸。因此,ADA和XO的活性可衡量嘌呤核苷酸分解代谢状况。本实验中海洛因组脑皮质中ADA和XO mRNA水平显著高于对照组,海洛因+AMP+GMP组ADA和XO mRNA水平虽明显高于对照组,但比海洛因组有大幅度的降低,说明海洛因促进皮质ADA和XO mRNA的表达,而同时补偿嘌呤核苷酸可抑制海洛因的作用。

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)是补救合成途径的关键酶。本实验中海洛因组脑皮质HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量均比对照组明显降低,而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量比海洛因组明显升高,与对照组水平相近,说明海洛因抑制脑皮质HGPRT,APRT,AK mRNA的表达,该作用可被同时补偿嘌呤核苷酸抑制。

海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因+AMP+GMP组相比,各目的基因mRNA表达量均无显著性差异,这与体内嘌呤核苷酸的相互转变有关。单纯补充AMP或GMP与同时补充AMP和GMP相比,对海洛因依赖大鼠各目的基因mRNA表达量的影响无明显差异。

综上所述,海洛因给药可以使大脑皮质ADA及XO mRNA表达增强,HGPRT、APRT和AK mRNA表达降低,提示海洛因在基因水平上促进嘌呤核苷酸分解代谢,降低合成代谢,而补偿嘌呤核苷酸可抑制上述作用。嘌呤核苷酸因其所表现出来的对海洛因的拮抗作用有望成为治疗海洛因依赖的工具。

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[4]闫晓凯,洪 敏,刘 畅,等.吗啡在基因水平对脑嘌呤核苷酸代谢的影响[J].中国药物依赖性杂志,2005,14(3):187.

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[6]何淑芳,杨林,黄维娟.应用SYBR荧光实时定量 RT2PCR法检测TGF-β1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中PA I-1 mRNA表达[J].中国药理学通报,2009,25(1):64.