Survivin-siRNA对裸鼠视网膜母细胞瘤移植瘤的抑制研究

吴 荒,孙 莹,张小猛,刘喜春,张 灵,吴雅臻*

(1.吉林大学第二医院,吉林长春130041;2.吉林大学第一医院;3.吉林大学前列腺疾病防治研究中心)

视网膜母细胞瘤是15岁以下儿童中最常见的原发性眼内恶性肿瘤[1-3]。Survivin属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成员。具有控制有丝分裂和对抗细胞凋亡两种作用[4]。Survivin基因在分化完全的组织中不表达或低表达;在大多数癌症组织中却有很强的表达[5]。本研究建立裸鼠视网膜母细胞瘤玻璃体移植瘤模型,采用RNA干涉技术,探讨Survivin-siRNA对肿瘤细胞中Survivin表达的抑制以及对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。

1 材料和方法

1.1 材料和对象 带有U6启动子及GFP的质粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP购于上海吉凯化学公司,全长6 380 bp。JM109由吉林大学前列腺疾病防治中心保存。Y79细胞株购于中国科学院上海细胞所细胞库。裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所,4-6周龄,体重18-20 g,饲养于恒定温度(22-25℃)、恒定湿度(40%-50%)的SPF层流室中,经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。

1.2 构建Survivin-siRNA真核重组质粒[6]根据shRNA的设计原则,针对Survivin mRNA特异的靶序列,合成针对其编码区394-412位碱基序列寡核苷酸链,由上海生物工程技术有限公司合成:shRNASurvivin:5′-GATCCCGCAGTTTGAAGAATTAACCTTCAA GAGAGGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT-3′(sense strand),5′-AGCTATCCAAAAAGCAGTTTGAAGAATTAA CCTCTCTTGAAGGTTAATTCTTCAAACTGCGG-3′(antisense strand);shRNA-Scramble对照:碱基顺序随机排列,与人类基因的外显子没有同源性。合成的DNA在5′端和3′端分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的一部分。互补寡核苷酸链退火后分别与BamHⅠ和HindⅢ线性化的载体相连,构建重组质粒pGCsilencer-U6-siRNA-survivin(以下简称Survivin-siRNA)和pGCsilencer-U6-siRNA-Scramble(以下简称ScramblesiRNA)。

1.3 裸鼠移植瘤模型建立 Y79细胞培养于含10%胎牛血清的IMDM培养液内,置于含5%CO2,37℃的细胞培养箱。当细胞生长至对数生长期时,离心收集细胞,用Hank液洗涤细胞2次,用不含血清的IMDM培养液悬浮细胞,细胞密度为(4.5-5.5)×107/ml。裸鼠21只,所有实验眼均选择右眼,乙醚麻醉,复方托比卡胺滴眼液(美多丽)散瞳。在体式显微镜下,将鼠上下眼睑拨开,可以眼球突出于睑裂 ,使用5 μ l微量注射器吸取 5 μ l细胞悬液自角巩膜缘部位刺入玻璃体腔,在玻璃体腔内清晰看到注射器针尖,而后缓缓推注细胞悬液,注射后退针。每天观察裸鼠各种生活变化,每隔3天采用乙醚麻醉,裂隙灯下观察玻璃体腔内情况。必要时可用盖玻片轻压角膜,即可观察到后部玻璃体及眼底情况。

1.4 抑瘤实验设计 将Y79细胞种植至21只裸鼠玻璃体腔内,于注射后9天进行抑瘤实验。将21只裸鼠随机分为3组:组1为mock对照组(n=7),注射 10 μ l K-PBS(NaCl 30.8 mmol/L 、KCl 20.7mmol/L、Na2HPO48.1 mmol/L 、KH2PO41.46 mmol/L 、MgCl210 mmol/L溶解于双蒸水);组2为Scramble对照组(n=7),注射带有非同源的Scramble-siRNA的重组质粒;组3为Survivin实验组(n=7),注射特异性Survivin-siRNA重组质粒。质粒注射剂量为10 μ g/只,质粒溶解于K-PBS,定量,调节质粒浓度为1 mg/ml。在注射结束后均于注射局部实行电转染以提高质粒在瘤体内的转染效率。将两根银电极分别置于内、外眦部位,轻压即可见眼球突出,此时玻璃体腔内肿瘤位于电极中央。电脉冲治疗仪的参数设定:电场强度为500 V/cm,脉冲时值5 μ s,次数 2次,频率 1 Hz。观察裸鼠各种生活变化,观察肿瘤大小变化。在给药后10天摘除眼球,完整剥离肿瘤,一部分用10%甲醛液固定;另一部分新鲜组织提取总RNA和总蛋白。

1.5 半定量RT-PCR检测Survivin基因表达 取转染组织100 mg,用玻璃匀浆器充分匀浆。用Trizol试剂盒提取总RNA,经逆转录反应合成cDNA。遵循PCR引物设计原则,根据GeneBank人Survivin基因和β-actin基因cDNA序列分别设计引物并由上海生物工程公司合成。Survivin上游引物:5′-GAATTCA TGGGTGCCCCGACGTTGCC-3′;下游引物 :5′-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC-3′,扩增片断长度为475 bp。PCR扩增反应条件:首先94℃5 min;而后94℃变性30 s,59℃退火45 s,72℃延伸2 min,共30个循环;最后72℃延伸5 min。β-actin作为内参照,其扩增片段长度为630 bp。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,紫外灯下拍照。

1.6 Western blotting检测Survivin蛋白表达 对转染后72 h的组织进行裂解,应用Bio-rad测定蛋白含量。取总蛋白 50 μ g作SDS-PAGE电泳。电泳结束后,将PVDF膜用甲醇平衡30 s,用Blotting buffer将膜、胶及Whatman滤纸浸泡10 min,用电转仪将蛋白转移到 PVDF膜上。PVDF膜用 Blocking buffer(5%脱脂奶粉)封闭4℃过夜。按Western blot流程依次加入survivin兔抗人多克隆抗体(1∶100),碱性磷酸酶标记的羊抗兔多克隆二抗(1∶2 000),用显色液显色,晾干拍照。

1.7 Survivin及Ki67免疫组化染色 取10%甲醛固定后的组织,石蜡包埋,4 μ m连续切片分别行HE染色和免疫组织化学染色。Survivin免疫组化染色:以在肿瘤细胞胞浆或细胞间质内出现棕黄色颗粒,且着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。Ki67免疫组化染色:以肿瘤细胞核呈现棕黄色或棕褐色细颗粒为阳性,每张切片观察3个视野,每个视野连续数出300个细胞,并且计算增殖指数(PI)。PI(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡 按TUNEL凋亡检测试剂盒(北京中山公司)说明书进行操作。石蜡切片做凋亡检测。细胞核染为棕黄色的即为凋亡细胞。每张切片观察3个视野,每个视野连续数300个细胞,计数凋亡细胞百分比即为凋亡指数(AI)。AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.9 统计学处理 利用SPSS 11.0统计软件包处理。半定量RT-PCR及Western blot均分别做3次。Ki67免疫组化染色计算增殖指数及TUNEL法计算凋亡指数,每组均随机选择3只动物的病理切片,每张切片观察3个视野,即每组9个数据进行多个样本间比较的方差分析,具体采用Bonferroni检验。

2 结果

2.1 成功构建重组质粒 重组质粒Scramble-siRNA和Survivin-siRNA转化JM109后,小量提取质粒,分别选取阳性克隆进行测序,结果与所设计的寡核苷酸序列一致,证明真核表达质粒构建成功[6]。

2.2 抑瘤实验观察 组1为mock对照组(n=7);组2为Scramble-siRNA对照组(n=7);组3为Survivin-siRNA实验组(n=7)。组 1、组2、组3肿瘤均继续生长。但组3肿瘤组织较干燥,眼周新鲜血管组织较少,组1与组2的生长状况无差别。组3中有一例发生了眼球萎缩,肿瘤消失。

2.3 半定量RT-PCR检测肿瘤组织Survivin mRNA的表达 运用GIS凝胶分析软件光密度扫描分析,以mock组Survivin产物与内参β-actin产物的电泳亮度比值定为1,Scramble-siRNA组(0.95±0.03)与mock组无差别(P＞0.05),实验组(0.27±0.06)亮度明显减弱(P＜0.01),见图1。这表明重组质粒SurvivinsiRNA在mRNA水平上抑制了Survivin基因转录。

图1 转染质粒后Y79移植瘤中Survivin mRNA的半定量RT-PCR分析

2.4 Western blot方法分析Survivin蛋白的表达光密度扫描分析以mock组的Survivin与内参β-actin的杂交带亮度比值定为1,与mock组和ScramblesiRNA组(0.96±0.03)相比,实验组(0.30±0.09)细胞的Survivin蛋白表达显著降低(P＜0.01)(见图2)。Western blot结果进一步证实了构建的siRNA质粒可在蛋白水平上抑制Survivin表达。

图2 转染质粒后Y79移植瘤中Survivin蛋白的Western blot分析

2.5 组织形态学观察 用苏木素-伊红(HE)染色普通光镜下观察,实验组与两对照组相比,在瘤组织内可见到较多死亡细胞,表现为较多细胞碎片,细胞核固缩碎裂,组织结构消失,呈现无结构嗜伊红染色区等形态学改变。

2.6 免疫组化染色 Survivin表达的阳性颗粒主要位于肿瘤细胞的胞浆内,也可见于少数细胞核中。Survivin-siRNA组移植瘤组织中Survivin蛋白表达与mock组和Scramble-siRNA组相比明显下降。

Ki67表达的阳性颗粒主要位于肿瘤细胞的胞核内,Survivin-siRNA组Ki67的表达较对照组下降明显;增殖指数明显下降(Mock组:63.67±7.26;Scramble-siRNA组:56.63±6.49;Survivin-siRNA组:8.67±5.24;P＜0.01)。

2.7 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡 Survivin-siRNA组肿瘤组织内可见大量细胞核染为棕黄色的凋亡细胞,对照组可见少许凋亡细胞。治疗组凋亡指数明显高于对照组(Mock组:2.33±1.63;Scramble-siRNA组:3.67±1.75;Survivin-siRNA组:38.17±3.76;P＜0.01)。

3 讨论

视网膜母细胞瘤是儿童中最常见的原发性眼内恶性肿瘤,出现首个体征的平均年龄为生后7个月(双侧发病病例)和24个月(单侧发病病例)[7]。Survivin属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成员,具有控制有丝分裂和对抗细胞凋亡两种作用。Survivin在正常成人组织中几乎不表达,但在大多数癌症组织中都有很强的表达。在癌细胞中,Survivin表达量增加与细胞增殖指数增加[8]、凋亡水平下降[9]、抵抗化疗药物能力增强[10]、肿瘤复发率增加相关[11]。我们在以往的研究中发现,Survivin在视网膜母细胞瘤组织中表达上调[12]。由于视网膜母细胞瘤具有特异的基因缺陷,可以对其进行基因治疗。如果采用特定的Survivin分子拮抗剂,抑制肿瘤组织中Survivin的表达,就有可能诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究选择了裸鼠作为荷瘤对象。采用的是经裸鼠角巩膜缘玻璃体腔内注射种植的方法,此法操作简便,便于肿瘤观察。本研究观察结果显示,肿瘤在玻璃体腔内生长速度较快:首先在玻璃体腔内较为弥散生长,而后聚集成瘤,1周左右眼球结构明显破坏,两周左右肿瘤明显突出于眼外。

本研究采用RNA干涉技术。在种植后9天,将Survivin-siRNA导入裸鼠视网膜母细胞瘤玻璃体腔移植瘤中,此时肿瘤在眼内已显著生长,但眼球突出并不明显。治疗时将质粒通过角巩膜缘直接注射入玻璃体腔肿瘤内部,而后进行电转染加强转染效果。给药后10天摘除眼球,完整剥离肿瘤。一部分新鲜肿瘤组织提取总 RNA和总蛋白,通过 RT-PCR在mRNA水平、Western blot在蛋白水平观察到SurvivinsiRNA抑制了肿瘤组织中Survivin的表达。另一部分肿瘤组织用10%甲醛液固定,通过Survivin、Ki67免疫组化染色和TUNEL法检测肿瘤组织凋亡均发现实验组的凋亡较对照组明显。本实验中出现了一个特例,即治疗组中有一例在注射质粒后眼球逐渐萎缩,肿瘤消失,全身状态良好。尚无法证明此例是治疗有效的体现,因为视网膜母细胞瘤本身存在自发性消退的现象,推测此例可能与此相关。

本研究结果显示,将构建的Survivin-siRNA重组质粒转染入视网膜母细胞瘤裸鼠玻璃体腔移植瘤中,抑制了肿瘤组织中Survivin基因转录和蛋白表达,诱导了肿瘤细胞凋亡。本实验为进一步开展基因治疗提供了更为直接的手段,为将来人类对视网膜母细胞瘤的治疗提供更多、更有效的选择。

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