高糖对体外培养的视网膜色素上皮细胞CD147表达影响

文海荣,吴雅臻,李小萌

(1.吉林大学第二医院眼科医院,吉林长春130041;2.东北师范大学生命科学学院)

CD147是一种分子量为50-60 kD的高度糖基化的单次跨膜糖蛋白,在眼角膜上皮、Müller细胞表面、视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium cell,RPE)和光感器细胞上均有表达,尤其在RPE中有高水平的表达[1]。CD147参与机体不同的病理生理过程,如机体的炎症反应,细胞-细胞或细胞-基质的粘附,刺激成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs),导致基底膜和细胞间质成分降解等。本研究通过观察高糖条件下培养的RPE中CD147的表达变化,为糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的发病机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 低糖DMEM(含5.56 mmol/L葡萄糖)及高糖DMEM(含25mmol/L葡萄糖),FBS胎牛血清(美国GIBCO公司);Trypsin胰酶Trypsin胰酶粉(Sigma),CD147兔抗人一抗(中杉金桥),Cy3羊抗兔二抗(Sigma)。人视网膜色素上皮细胞(中山大学细胞中心)。

1.2 实验方法

1.2.1 RPE细胞培养与处理 将RPE细胞于完全培养基(DMEM中加入10%胎牛血清,1‰双抗),置于37℃5%CO2恒温培养箱中培养。待细胞铺满瓶底80%左右时,用0.25%胰酶消化。在6孔细胞培养板中铺4个盖玻片,以2×105个/ml接种,100 μ l/孔。其中两个孔加入1 ml高糖完全培养基,另外两孔加入1 ml低糖完全培养基。将细胞混匀,用枪头轻轻压实铺在12孔板中的玻璃片,以防止气泡存留。将6孔板、放入37℃5%CO2恒温培养箱中,待细胞长至80%-90%,做免疫荧光检测。

1.2.2 免疫荧光检测CD147蛋白在RPE细胞中的定位 吸去培养基,500 μ l/孔预冷PBS洗细胞,吸出。10%甲醛固定液 500 μ l/孔,摇床放置30分钟。600 μ l/孔 PBS 洗三次 ,10 min/次 。0.1%TritonX-100 500 μ l/孔,摇床放置 5 min。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10min/次。2%BSA-PBS 500 μ l/孔 ,摇床放置封闭90分钟。600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。加CD147一抗(兔抗人)抗体:1%BSA=1∶2 000,500 μ l/孔,4度过夜(12小时),600 μ l/孔PBS洗三次,10 min/次。避光加二抗Cy3(羊抗兔),抗体:1%BSA=1∶1 000,300 μ l/孔 ,摇床放置 30 分钟 。600 μ l/孔 PBS 洗三次,10 min/次。封片液封片,镜检。

1.2.3 Western blot检测CD147蛋白在RPE细胞中的表达 实验细胞加入全细胞裂解液200 μ L,吹打裂解后,将裂解液置于4℃,12 000 r/min离心15 min,取上清液。定量样本加入6×样品缓冲液,行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。SDS-PAGE结束后,将凝胶与PVDF转印膜一起按电转移装置说明书要求安装并放入电泳槽中,加电转液在80 mA电流转移4 h。转膜后,脱脂奶粉封闭,一抗用封闭液以1∶1 000浓度稀释,按0.1 ml/cm2加到PVDF膜上,4℃过夜,孵育10 h。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,加到PVDF膜上,室温反应2 h。ECL法化学发光,X线底片曝光显影。β-actin为内参。

2 结果

2.1 免疫荧光检测CD147在RPE细胞上的分布CD147蛋白在RPE细胞中高表达。在低糖条件下,CD147主要集中在细胞核中,一部分位于细胞质中(图1)。在高糖条件下,CD147主要分布于细胞膜上,一部分位于细胞质中,细胞核中的CD147蛋白很少(图2)。

2.2 Western blot检测CD147在RPE细胞上表达量 CD147蛋白在RPE细胞上有表达。高糖条件下RPE细胞上CD147蛋白的表达量明显高于低糖条件下RPE细胞上的CD147蛋白(图3)。

图1 低糖条件下CD147蛋白在RPE细胞中的分布

图2 高糖条件下CD147蛋白在RPE细胞中的分布

图3 不同培养条件下CD147蛋白在RPE细胞上的表达量变化

3 讨论

CD147又称基质金属蛋白酶诱导因子,属于免疫球蛋白超家族成员,在体内分布非常广泛,参与各种不同的生理过程并具有多种不同的生理功能。近几年对CD147的研究主要集中在肿瘤疾病中,发现在大多数肿瘤疾病中CD147可促进细胞的异常增生,并通过上调MMPs的表达,促进肿瘤细胞的转移。且CD147的表达水平与肿瘤的恶性度正相关[2]。CD147还可与整合素作用影响细胞基质构建[3]。在类风湿性关节炎发病过程中,CD147可同过上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达促进的新生血管生成[4]。近来一些对于鼠RPE细胞上CD147的研究显示,CD147可能介导正常感光细胞与胶质细胞间的相互作用,与多聚单羧酸转运蛋白一起参与RPE和Müller细胞的浆膜转运、能量代谢[5]。

本研究结果显示CD147蛋白在RPE细胞上存在表达,同时存在于胞膜、胞浆和胞核中。在低糖培养条件下,CD147蛋白主要集中在细胞核中,一部分位于细胞浆;在高糖培养条件下,RPE细胞变长,CD147在RPE中的定位发生变化,由细胞核向细胞膜转移,主要存在于细胞膜上,部分位于细胞浆。由于CD147是一种膜蛋白,主要通过糖基化的程度和方式不同,与其他蛋白相互作用发挥作用,因此我们推测当环境中的葡萄糖浓度增加时,CD147蛋白由细胞内向细胞膜转移,在细胞膜上的功能性蛋白增多发挥更强的生物学作用。Western-blot结果证实,在高糖条件下CD147蛋白在RPE细胞中的表达量较低糖条件下明显增加。再次提示CD147蛋白可能参与了高糖条件下RPE细胞的生物学特性的变化。

综上我们可以推测,在高糖条件下,CD147蛋白的修饰及表达变化,促进RPE细胞的生物学特性的变化。这为我们研究糖尿病视网膜病变的发病机制提供了新的思路。

[1]Tervahartiala T,Kaarniranta K,Tang Y,et al.Immunolocalization of EMMPRIN(CD147)in the human eye and detection of soluble form of EMMPRIN in ocular fluids[J].Current Eye Research,2006,31:917.

[2]Nabeshima Kazuki,Iwasaki Hiroshi,Kaga Kaori,et al.Emmprin(basigin/CD147):matrix metalloproteinase modulator and multifunctional cell recognition molecule that plays a critical role in cancer progression[J].Pathology International,2006,56(7):359.

[3]Jiang Jian-li,Tang Juan.CD147 and its interacting proteins in cellular functions[J].Acta Physiologica Sinica,2007,59(4):517.

[4]Tang Y,Nakada MT,Rafferty P,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression by EMMPR IN via the PI3K-Akt signaling pathway[J].Mol Cancer Res,2006,4(6):371.

[5]Kenji Hori,Naomi Katayama,Sbu Kacbi,et al.Retinal Dysfunction in Basigin Deficiency[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:3128.