两种方法建立口腔念珠菌病动物模型的比较

吕秋菊,马晟利,代雪丽

(1.黑龙江省佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154002;2.黑龙江省医院,黑龙江 哈尔滨 150036)

两种方法建立口腔念珠菌病动物模型的比较

吕秋菊1,马晟利2*,代雪丽1

(1.黑龙江省佳木斯大学,黑龙江佳木斯 154002;2.黑龙江省医院,黑龙江 哈尔滨 150036)

*通讯作者

白色念珠菌常见于口腔和阴道。白色念珠菌感染好发于婴儿及老人,特别是口内有义齿基托的老人。但随着临床抗生素、抗癌药物及免疫抑制剂的应用,白色念珠菌病的好发人群已有扩大的趋势[1]。通过动物模型研究,可以深入了解广谱抗生素对白色念珠菌的影响。白色念珠菌病的动物模型研究,70年代始获成功。英国曼彻斯特大学Rusell[2],Jonse[3],Adams等发表了研究结果。80年代初,丹麦阿胡斯皇家牙科学院Fisker[4],Budtz-Jorgensen[5]等也对此进行过研究所使用的方法基本相同,建立模型的成功率为25%。其他国家(瑞典、挪威、美国)亦有零星报道,成功率亦不高。1994年章魁华、王洪君等[6]将建模成功率提高到了100%。但其侧重点为白色念珠菌病与癌症的关系。本研究的目的在于建立口腔粘膜白念感染的动物模型并比较青霉素组与普通组在建模方面的差别。亦致力于提高动物模型建立的成功率,为对白色念珠菌感染的认识及临床防治提供基础。

1 材料及方法

1.1 白色念珠菌 临床株98001传代菌种,由黑龙江省哈尔滨市药品检验所提供。

1.2 动物 Wistar大鼠,来自于佳木斯大学动物实验中心,实验开始时体重200±10 g,6-8周龄。饲料为佳大动物实验中心提供的标准料块。分笼饲养,每笼4只。笼具及饮水瓶洗净,灭菌后使用,每周1次。

1.3 实验方法 实验前无菌棉拭子涂抹Wistar大鼠口腔粘膜后做白色念珠菌培养,每周2次,共2周。白色念珠菌培养阳性的大鼠淘汰,共淘汰2只。阴性的大鼠随机分为以下3组:

1.3.1 对照组 18只,不加任何干预,每天在乙醚麻醉下,用无菌小油画笔蘸无菌PBS液涂抹大鼠右颊侧口腔粘膜2次。

1.3.2 青霉素组 40只,实验开始时在大鼠的饮水中加入阿莫西林使其浓度为1%,2周后浓度改为0.1%直至实验结束。同时每天在乙醚麻醉下,用无菌小油画笔蘸浓度为6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右颊侧口腔粘膜2次。每周用无菌探针轻划大鼠右颊侧口腔黏膜3下,以不划破黏膜为准。

1.3.3 普通组 40只,实验开始时大鼠的饮食不加干预,每天在乙醚麻醉下,用无菌小油画笔蘸浓度为6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右颊侧口腔粘膜2次。每周用无菌探针轻划大鼠右颊侧口腔黏膜3下,以不划破黏膜为准。

1.4 细菌检测 每4周全部动物停止涂白色念珠菌液1周,用15#无菌纸尖在大鼠右颊侧患病处反复涂抹10秒钟,取标本溶于20 μ l稀释液中,振荡 1 min使其充分溶解混匀。再依次进行10倍系列稀释至 10-6,从原液开始选择 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释度,滴种在沙保罗培养基上,37℃培养48小时后,记数菌落。

1.5 病理学检测 随机选择以上3组中建模成功的大鼠各1只,处死并取涂菌处粘膜固定、脱水、包埋和切片。常规HE染色和PAS染色光镜下观查以进一步确定建模成功。结果阳性者停止涂白色念珠菌液其它条件不变单独饲养,间隔1周再做白色念珠菌培养如结果阳性则认定建模成功,结果阴性者继续涂菌直至建模成功。

2 结果

2.1 全部对照组动物在试验过程中检菌皆为阴性,组织学检查亦皆为阴性。

2.2 实验组动物检查结果

2.2.1 临床观察可见涂菌侧颊粘膜表面白色绒状斑片,用力擦掉后可见红色充血糜烂面。与对照组有明显差异。

2.2.2 将于患处取分泌物涂片,经革兰氏染色,镜下见酵母样孢子。

2.2.3 将于患处取分泌物标本接种于沙保罗培养基上可见乳白色菌落,似奶酪样。

2.2.4 将于患处取分泌物标本接种于念珠菌显色培养基上可见淡绿色菌落,似奶酪样。

2.2.5 组织学检查 本实验的80只大鼠在结束实验时,处死以上四种检验均阳性的大鼠取其患处粘膜做病理学检测,PAS染色可见上皮棘层增生,上皮钉突呈圆形,基底膜部分被炎症破坏。在粘膜上皮外1/3有菌丝侵入。结果显示青霉素组和普通培养组白念病在组织学上无明显差异。

2.2.6 实验情况 见表1。多变量分析结果表明将各个时间点整体来看青霉素组11周的菌落数与普通组有统计学差异(P＜0.05)。由表1我们可以看出青霉素组菌落数在各个时间点菌落数均高于普通组,且随着时间的推移,差别越来越大。青霉素组的菌落数增长迅速,普通组菌落数相对缓慢。

表1 青霉素组与普通组11周的菌落数比较(±s)(cfu/ml)

表1 青霉素组与普通组11周的菌落数比较(±s)(cfu/ml)

*多变量分析结果表明青霉素组与普通组比较11周的菌落数有统计学差异,P＜0.05

组别 例数时间(周)1 3 5 7 9 11青霉素组* 40 0.17±0.08 0.96±0.15 2.46±0.15 4.26±0.31 5.84±0.23 6.54±0.43普通组 40 0.08±0.01 0.14±0.05 0.62±0.13 0.84±0.18 1.20±0.12 1.98±0.15

3 讨论

本研究的建模成功率为100%,且建模时间比相关文献要短。其原因可能为:一是青霉素组大鼠饮水中加入广谱抗生素,给予青霉素水时,采用了不间断给药,与其他研究不同(一般第1周给0.1%,第2、3周给0.01%,然后停止),这也可能是提高成功率的原因。二是青霉素组与普通培养组大鼠均每周用探针轻划粘膜表面,且不划破为准。既给粘膜表面造成了创伤,又不会因为创伤过大而造成粘膜深部感染。

在上述结论中青霉素组感染白色念珠菌比普通组明显,这也说明长期应用抗生素往往使得患者体内的微生态环境从一种失调转变成了另一种失调。口腔微生态平衡是指口腔生态系在一定时间内结构与功能的相对稳定状态,是口腔微生物和宿主生理功能的高度统一的平衡状态。当然,这种平衡是动态的平衡。健康口腔是口腔生态平衡的重要表现形式。在健康口腔中其结构和功能以及微生物的组成、分布均处于相对的稳定状态,并沿着正常的生理性演替次序进行着动态变化。然而,当在外界因素作用下,菌群的波动超过了微群落内部所能承受的能力后,口腔微生态失调随之发生,某些条件致病菌迅速生长、繁殖,有益菌明显减少,导致感染性疾病的发生。抗生素、免疫抑制剂等的长期、大量的使用可引起定植抗力明显减低,外源性特定致病菌入侵机会增大,导致特定感染性的疾病的发生。目前广谱抗生素的广泛应用,念珠菌的发病率显著增加。发病率的上升有两种原因:一是无针对性地应用“广谱”导致菌群失调;二是近些年人们对念珠菌病逐渐认识,诊断率提高的缘故。抗生素导致珠菌感染已被公认,人们对失调的机理一直在探讨,可能有以下几个原因:菌群失调、菌体成份、增强菌体毒性、自身毒性作用、降低免疫力。这就要求我们医务工作者慎用抗生素。

随着微生态学理论的发展和微生态调节剂的应用,生物拮抗作用逐渐被人们认识。未来的感染性疾病的治疗理念不再是杀灭所有的微生物,而是以通过扶持体内的有益菌来拮抗可疑的致病菌,以达到一种动态的,健康的微生态平衡。

[1]Almirante B,Rodriguez D,Park BJ.Epidemiology and Predictors of Mortality in Cases of Candida Bloodstream Infection:Results from Population-Based Sarcdlona,Spain,from 2002 to 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43(4):1829.

[2]Rusell C,Jonse JH.Effects of oral inoculation of candida albicans in tetracycline-treated rats[J].MedMicrobiol,1973,6:275.

[3]Jones JH.Adams D.Expeimentally induced acute oral candidosis in the rat.Brit J Derm,1970,83:670.

[4]Fisker AV.Long ter m oral candidosis in rats.Acta path microbial immunol scand Section B,1982,92:221.

[5]Budtz-Jorgensen E.Denture stomatitis.Anexperimental model inmonkeys.Acta Odontol Scand,1971,9:513.

[6]章魁华,王洪君,傅 嘉,等.口腔粘膜白色念珠菌感染的动物模型研究[J].中华口腔医学杂志,1994,29(5):266.

1007-4287(2010)02-0289-02

黑龙江省自然科学基金资助项目项目编号:D2007-03

2009-05-28)