延边地区健康人群Nelin基因单核苷酸多态性研究

王 琛,尤 昕,姜春善,柳明洙,崔鲜花,金春花,金春梅

(1.延边大学附属医院 检验科,吉林延吉133000;2.延边大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室)

Nelin基因是在构建正常成人的心脏cDNA文库及大规模筛选表达序列标签的基础上发现的,是一个肌组织特异表达的新基因[1,2]。其编码与大鼠肌动蛋白结合蛋白的基因Nexilin高度同源[3],其中间近N端(76-242aa之间)有一典型的F-actin结合结构域,现已证实与F-actin结合的特性,为一新的肌动蛋白结合蛋白[4,5],具有刺激细胞迁移和黏附的作用[6]。为了进一步研究Nelin基因的遗传特征和与疾病的关联,本研究对延边地区健康人群Nelin基因外显子的单核苷酸多态性(SNP)进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象 抽取经知情同意的114例体检的健康者EDTA-K2抗凝全血1 ml,朝鲜族男性27例,朝鲜族女性24例,汉族男性32例,汉族女性31例。

1.1.2 仪器与试剂 AxyPrep全血基因组DNA小剂量试剂盒购自北京经科宏达生物技术有限公司,PCR扩增试剂盒、DL2000 DNA分子量标准购自TaKaRa公司。

1.1.3 引物 针对Nelin基因第7、8、9、11四个外显子,应用Primer premier 5.0软件设计3对引物(由于该基因第7内含子仅有104个碱基,因此将第7外显子、第7内含子和第8外显子设计成一个片段进行扩增),由北京奥科公司合成。序列如下:扩增第7-8外显子片段所用引物为上游引物:5'-TGATGGAGGTAAAGTCCCAT-3',下游引物:5'-GTAGATTTACCAT TTGCCGC-3',片段长度:563 bp。扩增第9外显子片段所用引物为上游引物:5'-CCTGTGTGATA GTGGCTAAT-3',下游引物:5'-GCAAATACCTTCAACCAACT-3',片段长度:463 bp。扩增第11外显子片段所用引物为上游引物:5'-GATTGCTTAAACACAGGAAT-3',下游引物:5'-TGCTATTT ACT TCCCAGATT-3',片段长度:454 bp。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取用AxyPrep血基因组DNA小剂量试剂盒提取。

1.2.2 目的片段DNA扩增 以提取的基因组DNA为模板,用Taq DNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应条件(三个片段反应条件相同):25 μ l体系,96℃预变性3 min,96℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,循环35次,72℃延伸2 min,4℃2 min。

1.2.3 PCR产物的测序 由上海申速公司进行测序,应用DNAman软件ClustalW2工具进行序列分析与Genbank的Nelin基因序列对比分析。

1.2.4 统计学处理 根据H-W平衡定律计算SNP位点的基因型频率,利用χ2检验比较观察到的基因型频率与预期基因型频率之间的差异。应用统计学软件SPSS11.5进行 χ2检验;设定显著性意义水平α=0.05。

2 结果

2.1 扩增结果 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示第7-8外显子的扩增片段约为563 bp,第9外显子的扩增片段约为463 bp,第11外显子的扩增片段约为454 bp,与预期分子量相符(图1)。

2.2 Nelin基因片段测序结果 通过对4个外显子的测序分析,发现2个SNP位点,其中1个为NCBI数据库中报道的rs1166698位点,1个为新发现的位点,NCBI数据库中报道的本研究人群中没有发现的位点3个。

2.3 rs1166698位点结果分析 rs1166698位点为第8外显子区G-A错义突变(图2),其基因型频率为GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因频率为G:57.9%,A:42.1%。通过对延边地区人群该位点的民族、性别比对分析,基因型、等位基因频率在朝汉族、男女的分布无明显差异(表1)。

图1 PCR扩增产物电泳图

图2 rs1166698 SNP位点的测序结果

表1 Nelin基因 SNP位点(rs1166698)民族、性别、基因型和等位基因频率分布

2.4 新发现的SNP 新发现的SNP是第9外显子区A/G错义突变1195 A/G,密码子由AAA突变为GAA(图3),编码的赖氨酸转换为谷氨酸,野生基因型AA占88.6%(101/114),突变基因型AG为11.4%(13/114),未发现突变纯合子基因型。

3 讨论

Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白[3],其基因功能目前还不明确,最近的研究表明,Nelin具有刺激细胞迁移和黏附的作用[6],在细胞肥大、心肌缺血预适应模型中表达量增加[7,8],基因突变与扩张性心肌病相关[9],提示该基因在心脏的多种病理生理过程中起重要作用。在NCBI数据库最新登记的Nelin基因的人类SNP共有279个(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP),有8个cSNP,在 8个 cSNP中包括 1个同义SNP,一个单碱基插入突变,6个错义SNP。本研究所针对的是肌组织特异表达的Nelin基因,该基因的结构包含数据库中的NEXN基因的第7-第13外显子,在第8、9、11外显子区有 4个错义SNP。由于第7内含子仅有104碱基,因此本研究将第7与第8外显子作为一个片段,加上第9、11外显子共三个片段进行扩增和序列分析研究。

通过对4个外显子SNP位点的序列分析,发现2个SNP位点,其中 1个为NCBI数据库中报道的rs1166698位点,另一个是新发现的第9外显子区A/G错义突变1195 A/G。rs1166698位点为第8外显子区G-A错义突变(48364365 G/A),密码子由GGA突变为AGA,编码的甘氨酸(Gly)转换为精氨酸(Arg),此位点恰好位于基因的一个核定位信号区域。通过对延边地区人群该位点的分析,其基因型频率为GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因频率为G:57.9%,A:42.1%。该位点的基因型、等位基因频率与朝汉民族、男女性别的分布无关联。与欧洲人、北京汉族人群、东京的日本人群的对比分析,结果显示,延边地区健康人群Nelin基因多态位点rs1166698(基因型GG/GA/AA,等位基因G/A)的分布与欧洲人有显著差异。与中国北京的汉族人群比较有一定的差异,但差异不明显,与东京日本人比较差异非常小,基因型分布和等位基因频率非常接近(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP)。

综上所述,通过研究我们了解了延边地区Nelin基因相关SNP位点遗传分布特征,发现了一个新的突变位点。rs1166698位点位于基因的核定位信号区域,推测其对基因的功能会产生一定影响,因此,Nelin基因相关位点单核苷酸多态性分析研究,为接下来研究Nelin基因与疾病的关系,寻找新的疾病易感遗传标记奠定了基础。

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