小肽为配基的亲和层析介质纯化干扰素α-2a的研究

高利增,王雪梅,王立成,孙晓莉,李 惟,王丽萍,

(1.吉林大学生命科学学院,吉林长春130021;2.首都医科大学宣武医院,北京100053;3.吉林大学中日联谊医院,吉林长春130033)

干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要的细胞因子。根据对干扰素基因核酸序列分析结果表明,它于5-10亿年前即于生物学细胞中存在。是生物体内一类古老的保护因子。自它发现以来,大量的临床研究表明,干扰素在抗病毒性疾病和恶性肿瘤以及增强机体免疫调节能力方面有明显效果[1,2]。而且,随着分子生物学及DNA重组技术的迅速发展,已经应用基因工程技术为人类抗肿瘤、病毒生产出大量高效的干扰素。制备高纯度的重组干扰素通常采用单克隆抗体亲和层析的方法[3-5]。

1 材料与方法

1.1 亲和层析介质的制备 Sepharose 4B的悬浮:取CNBr活化的Sepharose 4B干粉(1克干粉可得湿树脂3.5 ml),用1 mM HCl溶解,并立即用1 mM HCl冲洗,每克树脂需200 ml,抽滤进行,约需15 min。(注:1 mMHCl必须抽滤彻底,尽量减少其存留量,以免影响偶联反应)。

配体偶联:取配体溶于Coupling Buffer中,每毫升树脂需配体的量为5-10 mg,Coupling Buffer用量为5 ml/g(树脂干粉)。把溶有配体的Coupling Buffer与悬浮完毕的湿树脂混合,进行偶联反应,反复振摇,室温下1 h或4℃过夜。反应完毕后用5倍树脂体积的Coupling Buffer洗去未反应的配体。掩埋剩余活性位点:将树脂转移到0.1MTris-HCl(pH8.0)中室温反应2 h。树脂洗涤处理:将上述树脂洗涤三轮,每轮用高低pH洗涤液交替洗涤,洗涤液用量为树脂体积的5倍。树脂处理完毕后,用上样缓冲液洗涤3次后即可使用。

1.2 亲和层析纯化干扰素 树脂的平衡:将树脂装柱后用3倍体积的上样缓冲液平衡。

上样:将含有一定浓度干扰素的上样缓冲液上柱,使干扰素与树脂发生特异性吸附。

非特异性洗涤:用3-5倍树脂体积的洗涤液洗涤树脂,去除非特异性吸附的杂质。

特异性洗脱:用1-3倍树脂体积的特异性洗脱液洗脱,并随时检测流出液的蛋白浓度,收集蛋白浓度较高时的流出液。

蛋白纯度的鉴定:纯化的蛋白经SDS-PAGE和HPLC分析,确定蛋白的纯度。

1.3 亲和层析介质纯化干扰素能力的评估 通过实验数据分析,得到这种方法纯化干扰素的指标,包括蛋白收率、纯化容量、纯化效率、可行性评估。

2 结果

2.1 亲和层析介质的制备

CNBr活化的Sepharose 4B树脂,与偶联的六肽配体的用量是10 mg小肽/1 g树脂。树脂与配体的偶联,小肽与蛋白是不同的,一般来说,肽配体的偶联量要高于蛋白配体,而且偶联效率也较高。实验中我们发现,介质的纯化能力和容量与偶联的六肽配体的多少直接相关,在树脂的量一定时,偶联的六肽越多,亲和层析介质纯化干扰素的容量就越大。

在六肽配体与树脂发生偶联反应时,将反应前和反应后的反应液在紫外下扫描,检测小肽的变化,从而确定偶联效率。实验中发现,当小肽的用量高达10 mg/g树脂时,偶联的效率仍可达99%(图1),从而说明亲和层析介质的制备比较成功。

本实验所用的六肽配体共有三种构型:L、1D和6D。L构型六肽是从噬菌体六肽库筛选得到的与干扰素α 2a特异性结合的肽配体。最初将L配体偶联于磁珠载体用于纯化干扰素,但发现这种亲和层析介质在反复使用几次后,纯化能力大大下降,经分析认为是在使用过程中六肽配体遭到酶解,为了防止肽配体的降解,于是又合成了1D和6D两种配体(表1),其依据的理论基础是肽配体构型改变后,不再是天然存在的L-构型氨基酸,可以抵抗蛋白酶的降解;同时考虑到以磁珠作亲和层析载体比较昂贵,不适合工业生产,需要寻找更普遍的材料作载体,因而又从 Phamacia公司购买了 CNBr活化的Sepharose 4B树脂作载体。实验中发现这三种小肽与树脂的偶联效率相当,说明小肽中氨基酸构型的改变不影响偶联效率。

图1 六肽与树脂的偶联反应图谱

表1 三种肽的氨基酸序列

2.2 亲和层析纯化干扰素

通过分析六肽配体的氨基酸序列,我们发现其氨基酸构成以疏水性氨基酸为主,因而推测六肽配体与干扰素的结合以特异性的疏水相互作用为主,依据疏水相互作用与溶液的体系的盐浓度相关的原理,我们把实验条件的摸索重点放在了离子强度方面,同时摸索了最适pH值。

实验中发现,当上样缓冲液pH值在6.0-7.5之间变化时,干扰素与树脂的吸附效率变化不大,所以选择pH 7.0作为以后最适pH,洗涤液同样对pH值的变化不敏感,洗脱液在pH 2.5-4.0之间均可将吸附的蛋白洗下,但pH值越小,洗脱效果越好;但是,当上样缓冲液中PBS的盐浓度在0.1-2M之间变化时,蛋白的吸附效率变化极为敏感,随着盐浓度的升高,蛋白的吸附效率也随之升高,但非特异性吸附杂志也增加,当洗涤液盐浓度略低于上样缓冲液时,洗涤效果非常明显,洗涤下来的杂质除非特异性吸附的杂质外,还包括一部分干扰素,从而证明六肽配体与干扰素的结合为特异性疏水相互作用;洗脱液在0.1M、pH2.5-4.0之间可将吸附的蛋白洗脱充分。依据上述变化规律我们最后确定的实验条件是:上样缓冲液2.0M、pH7.0,洗涤液1.8-2.0M、pH7.0,洗脱液 0.1M 、pH2.5-4.0。

2.3 亲和层析介质纯化干扰素能力的评估

根据1.2中总结得到的实验条件,利用此种亲和层析介质纯化干扰素,干扰素原液是经包含体变性复性后的透析液,经此纯化后,蛋白的收率高达85%(图2)。蛋白纯度达90%,HPLC鉴定(图3)。在纯化过程中,对洗涤液和洗脱液中的蛋白进行实时跟踪监测,流出液中的蛋白变化与预期相符。蛋白纯化过程的变化见图4。

图2 干扰素α-2a纯化结果

图3 干扰素α-2a纯化后的 HPLC

图4 干扰素α-2a纯化的实时监测

3 讨论

与制药工业生产的干扰素相比,用此种方法纯化得到的干扰素虽然纯度偏低,不能作为药物使用,但它作为亲和层析纯化方法,与传统的纯化方法相比,更为快速,简单方便,所需的步骤较少,蛋白的收率也较高;同时,以小肽作为亲和配体,与以单克隆抗体作为配体相比,前者纯化获得产品污染少,不会象单克隆抗体从介质脱落混入产品进而在人体引发抗原抗体反应。总之,以六肽作为亲和配体,为纯化干扰素提供了一个新的方法,本实验对此方法进行了初步的探索,为此方法将来的应用打下了基础。

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[3]栗克喜,唐玉琴,吴认艰.纯化HuIFN-α蛋白含量测定方法的研究[J].微生物学免疫学进展,2000,28(2):46.

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