不同疏水性能冠脉支架表面对溶血性能及蛋白吸附影响

张基昌,李淑梅,宋春莉,赵 雷,刘 佳,刘 斌*

(吉林大学第二医院,吉林 长春130041)

冠状动脉血管支架的应用是介入心脏学领域里的重要发展,支架内血栓形成是目前影响冠状动脉支架置入术预后的重要因素之一[3]。影响支架表面血栓形成的因素包括:支架表面张力及界面自由能、亲水性和疏水性、表面电荷等等[9,10]。优异的血液相容性需要亲水性和疏水性的平衡[10]。目前对于支架表面疏水强度改变对支架内血栓形成影响未有研究。由于目前临床应用的冠脉支架基本为316L不锈钢,故本文通过硅烷修饰316L不锈钢获得不同疏水强度的支架表面,探讨疏水强度改变对血液相容性及蛋白吸附的影响,为将来冠状动脉支架表面改性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

丙基三乙氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、γ-(2、3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(KH560,美国Sigma公司生产),枸橼酸钠抗凝血(长春市中心血站提供),316L不锈钢(购自沈阳国明繁华特种钢公司)、接触角测量仪为KRÜ SS DSA10-MK2,分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 不锈钢表面疏水处理 样品为2.0 cm×2.0 cm 316L不锈钢板,用丙酮超声处理15 min,之后用清水超声清洗干净。用15%的HCl溶液煮沸处理10 min,之后分别用蒸馏水、乙醇超声处理各三次。配制10%的氢氧化钠溶液,浸泡处理10 min,使钢片表面羟基化。之后用水、乙醇冲洗,红外灯烤干。将处理好的钢片浸入配制好的硅烷溶液,浸泡,之后用水冲洗,放入110℃烘箱烘干老化处理1 h。

1.2.2 接触角测试 用接触角测量仪测量角度,所用液滴为5 μ l。

1.2.3 溶血性能实验 每个样品各取5份,用镊子夹住材料,取蒸馏水洗涤3次,再用生理盐水洗涤3次。将洗涤好的材料放入广口瓶中在37度水浴中恒温30 min,加入0.2 ml稀释血液,恒温60 min。阳性对照和阴性对照分别用10 ml蒸馏水和10 ml生理盐水各加0.2 ml稀释血,与样品同样操作。随后以1 500 r/min离心5 min,取上清液2 ml放入比色杯中用分光光度计在545 nm测吸光度。每组实验重复3次。溶血率按如下公式计算:

溶血率=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100%

1.2.4 蛋白吸附实验 配制BCA工作液,制作标准曲线。取5 g白蛋白溶于1 ml去离子水中,恒温搅拌10 min,配制成5%的白蛋白溶液。将三种硅烷修饰的不锈钢板及裸不锈钢板置于6孔板中,每孔加3 ml 5%的白蛋白溶液,4℃保存48小时。保存时间到后,取每孔中的5%的白蛋白溶液配成0.05%浓度。放入96孔板中,每孔加200 μ l BCA工作液。将96孔板置于37℃放置30分钟。用分光光度计测562 nm处吸光值,根据标准曲线计算出蛋白浓度。

1.2.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示,采用SPSS10.0软件包对资料进行统计学分析,组间比较采用t检验,P＜0.05为统计学差异有显著性。

2 结果

2.1 接触角结果

不锈钢表面接触角值

从实验结果来看,单纯不锈钢表面为亲水表面(接触角＜90°),羟基化后不锈钢表面接触角略有增加,但仍为亲水。通过硅烷修饰不锈钢表面,不锈钢表面接触角均大于90,表面为疏水性能,说明其疏水强度增加与其羟基化处理无关,与硅烷接枝有关。同时不同硅烷的接枝可得到不同疏水性能的支架表面。

2.2 溶血性能实验结果

2.3 蛋白吸附实验结果

不同疏水强度表面吸附白蛋白量

疏水的不锈钢表面吸附白蛋白能力较亲水的裸不锈钢均明显减少,具有统计学差异。随着疏水强度增加,应用硅烷修饰的不锈钢表面其吸附白蛋白的能力增强。

3 讨论

自从1977年Gruentzig完成第一例冠心病介入治疗以来,冠状动脉内支架置入术已成冠心病治疗的重要手段。人们在关注冠状动脉支架置入术有效性的同时更重视其安全性,而支架内血栓(stent thrombosis,ST)问题仍是学术界讨论和研究的热点[1,2]。支架内血栓发生率虽然很低,但由此带来的后果却是致命性的。有关药物涂层支架的研究发现,发生ST后死亡率40%-50%,死亡和AMI总的发生率为50%-70%[3,4]。目前认为急性和亚急性血栓主要与支架置入不满意(如支架偏小或贴壁不良等),过早停用抗血小板药物等因素相关[5,6]。其中支架本身特性也是一个不可忽视的问题血液与冠脉支架接触后会引起血液的一系列变化,最快的变化就是血浆蛋白在支架表面吸附[10,11]。随着支架表面亲水及疏水结构的不同,在支架表面产生白蛋白、球蛋白及各种蛋白质的竞争性吸附,在此表面上形成了一层成分复杂的蛋白吸附层。吸附蛋白层形成后,这一蛋白吸附层将介导生物材料表面和生物内环境发生生物作用。一般地认为吸附白蛋白的能力越强,形成血栓的可能性就越小;而吸附纤维蛋白原越多,粘附血栓的可能性就越大[7,8]。故支架表面的亲水或疏水结构与支架内血栓形成存在密切关系。

目前对于支架表面何种强度疏水性能最佳无报道。本研究通过利用硅烷修饰目前支架材料316L不锈钢,获得支架表面疏水效果,通过改变硅烷链长来改变疏水强度。溶血实验被认为是细胞毒性评价的一个实验,材料直接与血液接触,因此有必要对其溶血性能进行评价。首先溶血试验结果显示本实验材料溶血率合格。研究发现单纯不锈钢表面及羟基化后不锈钢表面接触角均为为亲水,通过硅烷修饰不锈钢表面,不锈钢表面接触角均大于90°,说明其疏水强度增加与其羟基化处理无关。研究发现疏水的支架表面吸附白蛋白能力较亲水的裸不锈钢均明显减少,具有统计学差异。说明疏水支架表面从白蛋白角度评价较亲水支架表面易形成血栓。在接触角90°-120°范围,随着疏水强度增加,支架表面其吸附白蛋白的能力增强,形成血栓几率减少。但同时应该认识到,支架表面蛋白吸附对血栓的影响,要结合对纤维蛋白原、γ球蛋白的吸附量,今后可在此方向进一步研究对白蛋白、纤维蛋白原、γ球蛋白吸附及它们之间比例,更加全面评价对血栓形成的影响。

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