参一胶囊(Rg3)诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡

孙宝胜,张 矛,刘林林,孙 晶,侯吉光

(1.吉林省肿瘤医院放疗三科,吉林长春130021;2.吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科;3.吉林大学第二医院药剂科;4.吉林大学第二医院放疗科)

人参皂苷Rg3是从人参中提取的有效单体成分。研究证明,人参皂苷Rg3可通过抑制肿瘤血管形成,阻断肿瘤的浸润和转移[1,2];提高肿瘤病人免疫力,抑制转移,并降低肿瘤病人放、化疗后毒副作用[3]。本文通过观察人参皂苷Rg3对黑色素瘤细胞的存活率及细胞凋亡的变化,为其临床应用提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸盐缓冲液均购自 Invitrogen公司(Paisley,Scotland,UK)。Taurolidine(Taurolin)溶剂由Geistlich Pharm AG(Wolhusen,Switzerland)赠送。其他的化学试剂均购于sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。

1.2 细胞及培养

小鼠黑色瘤细胞(B16-4A5)购于美国细胞库(Manassas,VA)。B16-4A细胞均在含有10%小牛血清、青霉素(100 U·ml-1)和谷氨酰胺(2 mmol·L-1)的DMEM培养液培养,并在37℃、5%CO2孵箱中贴壁生长。

1.3 细胞增殖活性测定

待B16-4A5细胞生长至指数期,调细胞浓度为1×105·ml-1。将B16-4A5细胞种植在 96孔培养板(100 μ l·well-1)24 h 后 ,分别给予不同浓度的 taurolidine,并确定最终浓度分别为 0、10、25、50、100 和200 μ mol·L-1。5%的 PVP作为空白对照组。B16-4A5细胞在37℃、CO2孵箱中培养24和48h后,给予100 μ l MTT(5.0g·L-1),37℃继续培养3 h,终止培养 ,吸去上清,每孔加入150 μ L二甲基亚砜,振荡 10 min在酶联免疫吸附仪上测量各孔光吸收值(CPM)。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组CPM值/对照组CPM 值)×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

待B16-4A5细胞接近对数生长期,常规消化细胞,制成2.5×105·mL-1细胞悬液,接种于 6孔培养板中。24 h后,实验组给予上述不同浓度的taurolidine。5%的PVP作为空白对照组。B16-4A5细胞在37℃,CO2孵箱中培养24和48 h后,将贴壁及悬浮的细胞离心,收集后震荡、混匀,在碘化丙啶(PI)混合溶液中(50 mg·L-1PI,3.4 mmol·L-1sodium citrate,1.0 mmol·L-1Tris,0.1 mmol·L-1EDTA,0.1%Triton X-100),并在4℃环境中避光培养4-6 h。流式细胞仪(BD biosciences,Mountain View,CA)进行检测,Cell Guest软件(BD Biosciences)收集并分析结果。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对B16-4A5细胞的生长抑制作用

表1是不同浓度人参皂苷Rg3分别作用于B16-4A5细胞24和48 h后,对 B16-4A5细胞增殖能力的影响。从表1可见,人参皂苷Rg3抑制B16-4A5细胞生长是随时间和剂量而改变的,具有明显的时效和量效的关系。

表1 不同剂量Rg3对B16-4A5细胞生长抑制率的影响

表2 不同剂量Rg3对B16-4A5细胞凋亡的影响

2.2 人参皂苷Rg3对B16-4A5细胞凋亡的影响

表2是不同浓度人参皂苷Rg3分别作用于B16-4A5细胞24和48 h后凋亡的影响。对照组的B16-4A5细胞在培养48 h后,仅仅产生了小于5%的细胞凋亡;然而,细胞经过50μ mol·L-1的人参皂苷Rg3作用后,能够诱导15%的细胞凋亡,并显示了明显的时间和剂量依赖效应(表2)。

3 讨论

黑色素瘤作为皮肤癌的一种,其发病率一直在世界范围内居高不下[5,6]。由于恶性黑色素瘤细胞很难被化学药物及辐射诱导凋亡,所以对这些传统的治疗手段具有明显的抗性。

刘基[4]等研究表明,人参皂苷Rg3对小鼠Lewis肺癌有抑瘤作用,本实验结果与其相符。结果显示,人参皂苷Rg3具有明显的诱导B16-4A5细胞凋亡以及抑制细胞生长的特性,并且显示了明显的时间与量效的依赖关系。

[1]赵 翌.20(R)-人参Rg3抗肿瘤作用的研究进展[J].临床肿瘤学,2001,6(1):81.

[2]明 月,朱玉琢,拱中华,等.人参二醇组皂甙对视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用[J].吉林大学学报,2003,2(29):149.

[3]胡笑克,吴利华,胡祖光.薏苡仁酯对鼻咽癌细胞的放射增敏作用[J].中山医科大学学报,2000,12(5):234.

[4]刘 基,孙亮新,赵 翌,等.参一胶囊对乳腺癌化疗患者免疫扶正Ⅱ期临床研究[J].中国肿瘤临床,2000,27:534.

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