丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2和CREB磷酸化水平的影响

张 英,陈 鹏,郑利民

(1.北京大学深圳医院麻醉科,广东 深圳518036;2.吉林大学中日联谊医院 麻醉科,吉林 长春130033)

细胞外信号调节激酶(ERK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是传递丝裂原信号的信号转导蛋白。在对学习记忆相关的行为学实验以及LTP的诱导和维持的研究中发现,应用阻滞剂抑制ERK1/2的激活后,海马LTP的诱发被抑制[1],小鼠水迷宫空间学习记忆能力[2,3]和大鼠条件性恐惧的学习记忆能力[4,5]均被削弱,因此,ERK1/2信号通路的激活与LTP和学习记忆功能密切相关。进一步的研究表明,ERK1/ERK2信号转导通路的激活参与了短时记忆形成和短时记忆向长时记忆的转化即记忆的巩固过程[6,7]。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是转录/翻译因子家族的一员,其磷酸化水平的增加参与了长时程增强(LTP)的维持和长时记忆形成[7,8]。丙泊酚(2,6-二异丙酚)是一种高效能的经典静脉麻醉剂,在临床上广泛用于全身麻醉诱导、维持和局部麻醉及重症监护病房患者的镇静。与其他静脉麻醉剂一样,除了镇静、催眠和麻醉作用外,丙泊酚还具有遗忘作用[9-11]。其明确的顺行性遗忘作用有助于避免和减少恐惧记忆的获得和存储,从而可以减少患者围手术期精神创伤和术后认知功能障碍的发生机率,其机制是否与ERK1/ERK2和CREB的磷酸化水平有关尚未定论。本研究拟评价丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2和CREB的磷酸化的影响,探讨丙泊酚顺行性遗忘作用的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器 丙泊酚(10 mg/ml,批号:GF045,AstraZeneca S.p.A公司,意大利)。磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)多克隆兔抗体、ERK1/ERK2多克隆兔抗体和磷酸化CREB(p-CREB)多克隆兔抗体及CREB多克隆兔抗体(一抗,Cell Signaling,美国),β-actin多克隆兔抗体(一抗,北京中杉金桥生物技术有限公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体(二抗,北京中杉金桥生物技术有限公司),ECL化学发光试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),Alpha ImagerTM2200图像分析处理系统(Alpha Innotech公司,美国),考马斯亮蓝G-250(上海化学试剂公司),其他化学试剂均为国产分析纯,用双蒸水配制,调pH值至7.4。DBA-2大鼠避暗程序自动控制仪(中国医学科学院药物研究所)。

1.2 动物选择与分组 健康成年雄性SD大鼠80只,体重250-300 g,由广东省医学实验动物中心提供。实验前适应环境1周,室温22℃-25℃,明暗周期12 h/12 h,湿度50%-60%,自由饮食。随机分为2组(n=40),对照组和咪达唑仑组。咪达唑仑组于训练前15 min腹腔注射咪达唑仑3 mg/kg,容量为2 ml/kg,对照组注射等容量生理盐水。

1.3 认知功能的测试 采用避暗箱实验测试大鼠认知功能。将避暗箱链接DBA-2避暗程序自动控制仪。该仪器分明暗两室,明室为透明的树脂材料,明室上方10 cm固定一25 W钨丝灯照明,暗室为黑色不透明的树脂材料,明暗两室中间有一直径6 cm的圆形滑门。明暗两室底部为直径6 mm的铜栅,暗室箱底交流电压为36 V,电流为1.5 mA。首先对大鼠进行训练,将其置于明室背对滑门,60 s之后将门打开,当大鼠进入暗室后(即大鼠的四肢全部进入暗室)给予其足部电击使其逃回明室,直至大鼠不再钻入暗室,记录100 s内大鼠不再钻入暗室所需的训练次数,在明室停留时间超过100 s认为大鼠对电击刺激形成了记忆。于训练结束后1、3、24 h(T1-3)时测试其记忆能力,只给予灯光刺激,当大鼠进入暗室后不给予足部电击刺激,记录大鼠在明室停留的时间即记忆潜伏期,当大鼠在明室停留时间超过600 s认为其记忆保持牢固,没有发生遗忘。

1.4 p-ERK1/ERK2和p-CREB表达的测定 各组于给药后15 min(T0)和T1-3记忆能力测试结束后,各断头处死8只大鼠,冰皿上分离海马,液氮冻存备用。取冻存的海马组织,加入裂解液,冰上匀浆,超声破碎,4℃下15 000 r/min离心15 min,取上清液,BCA法测定蛋白浓度。取50 μ g蛋白上样,10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,电泳条件:恒压,积层胶60 V,分离胶100 V。电泳结束后进行蛋白质转膜,转膜条件:硝酸纤维素膜(NC),恒流,电流100 mA,冰上转膜4 h。印迹膜在含 5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液中封闭1 h,TTBS漂洗3次,每次5 min,分别与 ERK1/ERK2及 p-ERK1/ERK2一抗(1∶1 000)、CREB 及p-CREB 一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶1 000)进行杂交反应,4℃过夜,TTBS漂洗 3次,每次5 min。再将NC膜与HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室温下摇床杂交反应1 h,再用TTBS漂洗3次,每次5 min,加入 ECL试剂反应1 min后,保鲜膜包裹,暗室进行X线胶片曝光、显影和定影。X线底片曝光显影所示条带放入Alpha ImagerTM 2200图像分析处理系统,利用Alpha Ease 40软件进行光密度扫描分析。以ERK1/ERK2和CREB吸光度值与β-actin吸光度值之比表示ERK1/ERK2和CREB的表达,以 p-ERK1/ERK2和 p-CREB吸光度值与ERK1/ERK2和CREB吸光度值之比表示p-ERK1/ERK2和p-CREB的表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,组内比较采用单因素方差分析,组间比较采用成组t检验;偏态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(Q)]表示,组内和组间比较采用秩和检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚组大鼠不再钻入暗室所需的训练次数3(1.25)较对照组1(0.25)增加(P＜0.01)。与T1时比较,生理盐水组其它时点记忆潜伏期差异无统计学意义(P＞0.05),丙泊酚组其它时点记忆潜伏期缩短(P＜0.01);与生理盐水组比较,丙泊酚组T2,3时记忆潜伏期缩短(P＜0.01),见表1。

2.2 两组大鼠各个时点海马ERK1、ERK2和CREB的表达均无差异(P＜0.05),见表2。

表1 两组大鼠训练结束后各时点记忆潜伏期的比较[s,n=8,M(Q)]

2.3 与T0时比较,生理盐水组T1-3时p-ERK1,p-ERK2和p-CREB表达上调,丙泊酚组T1,2时p-ERK1表达上调,T3时p-ERK1表达下调,T1-3时p-ERK2水平上调,T2时p-CREB水平上调;与生理盐水组比较,丙泊酚组T2,3时p-ERK1表达下调,T0-3时 p-ERK2和p-CREB表达下调(P＜0.01),见表3。

表2 两组大鼠各时点海马ERK1、ERK2和CREB表达的比较(n=8,±s)

表2 两组大鼠各时点海马ERK1、ERK2和CREB表达的比较(n=8,±s)

指标 组别 T0 T1 T2 T3 ERK1 group S 0.87±0.08 0.86±0.06 0.87±0.09 0.88±0.10 group P 0.86±0.11 0.84±0.11 0.85±0.08 0.89±0.07 ERK2 group S 0.97±0.09 1.00±0.06 0.99±0.10 1.04±0.09 group P 0.97±0.09 0.99±0.12 1.03±0.03 1.04±0.10 CREB group S 1.01±0.08 1.02±0.10 1.01±0.11 1.02±0.10 group P 1.04±0.10 1.03±0.14 0.99±0.08 1.02±0.12

表3 两组大鼠各时点海马 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表达的比较(n=8,±s)

表3 两组大鼠各时点海马 p-ERK1、p-ERK2和p-CREB表达的比较(n=8,±s)

与生理盐水组比较,*P＜0.01;与T0时比较,#P＜0.05

指标 组别 T0 T1 T2 T3 p-ERK1/ERK1 group S 0.63±0.06 0.77±0.05# 0.78±0.08# 0.83±0.07#group P 0.54±0.10 0.77±0.05# 0.63±0.04*# 0.45±0.04*#p-ERK2/ERK2 group S 1.29±0.12 2.99±0.17# 2.99±0.39# 2.21±0.15#group P 0.90±0.07* 1.28±0.17*# 1.21±0.10*# 1.01±0.08*#p-CREB/CREB group S 0.89±0.06 1.74±0.12# 1.97±0.19# 1.59±0.14#group P 0.33±0.06* 0.31±0.07* 0.51±0.06*# 0.30±0.04*

3 讨论

本研究采用大鼠连续多次明暗被动回避性条件反射实验,观察丙泊酚对条件性恐惧记忆获得和存储的影响,该法简单易行,对记忆过程,特别是对伤害性刺激所产生的恐惧记忆的再现有较高的敏感性[12]。研究表明,丙泊酚的遗忘作用与其镇静作用关系并不密切[13,14],大鼠在小剂量(9-25 mg/kg)条件下主要影响记忆功能表现为比较明确的遗忘作用,不影响运动能力和情感,因此本研究选择丙泊酚的剂量为9 mg/kg,结果表明,与生理盐水组比较,丙泊酚组不再钻入暗室所需的训练次数增加,T2,3时记忆潜伏期缩短,且都小于600 s,提示训练前腹腔注射丙泊酚9 mg/kg破坏了大鼠被动回避恐惧条件的学习能力,缩短了恐惧记忆的存储时间,产生顺行性遗忘,与以往的文献结果基本一致[9]。本研究结果还表明,丙泊酚在训练结束1 h后产生顺行性遗忘,进一步说明了丙泊酚对短时记忆的形成没有影响,但抑制了短时记忆向长时记忆的转化,即记忆的巩固过程。

本研究结果表明,与T0时比较,生理盐水组T1-3时 ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平均升高,ERK1磷酸化水平持续升高至T3时达峰值,ERK2磷酸化水平在T1,2时达峰值,CREB磷酸化水平于T2时达峰值,这一结果与文献报道的ERK1、ERK2和CREB在学习记忆行为中的变化基本一致[15],也进一步说明了ERK1、ERK2和CREB参与了长时记忆的形成。ERK1/ERK2通过苏氨酸和酪氨酸磷酸化后被激活,ERK1/ERK2被激活后发生核转位可直接激活转录因子 Elk-1,后者作用于血清反应元件(SRE),并作为许多即刻早期基因(IEG)的上游DNA序列,启动IEG的转录;ERK1/ERK2也可通过激活核糖体S6激酶(Rsk)来激活转录因子CREB,从而作用于cAMP反应元件(CRE),启动CRE依赖性的转录。此外,ERK1/ERK2也可直接磷酸化转录因子CREB[7]。可见,ERK1/ERK2磷酸化水平升高后可易化其下游的转录翻译,调节突触蛋白的分布和功能,在突触可塑性及记忆形成中发挥重要作用[7,16]。

研究表明,丙泊酚的镇静、催眠和遗忘作用与中枢GABA能神经系统的兴奋和NMDA能神经系统的抑制均相关[17-20]。研究也证实,丙泊酚对海马长时程增强(Long-Term Potentiation,LTP)具有抑制作用[21],而且可能与抑制NMDA介导激活的细胞外信号传导通路(ERK1/2)密切相关[18]。在LTP的诱导过程中,NMDA受体被激活后可激活ERK1/ERK2信号通路,使其下游的转录因子Elk、CREB被激活并进一步易化基因的表达[22]。本研究结果显示,与生理盐水组比较,丙泊酚组T2,3时p-ERK1表达下调,T0-3时p-ERK2和p-CREB表达下调,丙泊酚产生的顺行性遗忘过程海马ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平仅短暂升高,提示丙泊酚对大鼠明暗被动回避训练激活的海马ERK1/ERK2和CREB蛋白磷酸化水平有抑制作用,这进一步证明丙泊酚遗忘作用与抑制ERK1/ERK2通路的激活进而抑制LTP的诱导和维持密切相关。我们在实验前15 min腹腔注射9 mg/kg的丙泊酚,大鼠学习获得能力有缺陷,但短时记忆的形成没有受到影响,这与Trifilieff的研究一致[15]。Trifilieff于被动回避训练前30 min海马内微量注射MEK的选择性阻断剂U0126,破坏了短时记忆的存储,与对照组比较,海马ERK1/ERK2和CREB蛋白无明显的磷酸化水平升高过程,这一结果与我们在实验中观察到的丙泊酚的作用相似,提示丙泊酚可能通过阻断ERK1/2激活后进一步级联反应激活CREB,从而抑制了短时记忆向长时记忆的转化而发生遗忘。ERK1/2信号转导通路被认为是细胞外多种刺激传向细胞内的交汇点,CREB是这些激酶级联的下游靶位,因此,研究多证实阻断ERK1/2活化的同时也会阻断CREB蛋白的激活,但外界刺激引起Ca2+进入细胞后,与钙调蛋白结合也可以通过激活Ca2+/CaM依赖蛋白磷酸化CREB[16],因此,咪达唑仑对大鼠明暗被动回避训练激活的海马CREB蛋白磷酸化的抑制作用也可能是与ERK1/2的活化无关,而是直接抑制了CREB的磷酸化。

综上所述,丙泊酚的顺行性遗忘作用可能与抑制大鼠海马ERK1、ERK2和CREB磷酸化水平相关。

[1]English,JD Sweatt,JD.A requirement for the mitogen-activated protein kinase cascade in hippocampal long term potentiation[J].J Biol Chem,1997,272(31):19103.

[2]Blum S,Moore AN,Adams F,et al.A mitogen-activated protein kinase cascade in the CA1/CA2 subfield of the dorsal hippocampus is essential for long-term spatial memory[J].J Neurosci,1999,19(9):3535.

[3]Selcher JC,Atkins CM,Trzaskos JM,et al.A necessity for MAP kinase activation in mammalian spatial learning[J].LearnMem,1999,6(5):478-90.

[4]Cannich A,Wotjak CT,Kamprath K,et al.CB1 cannabinoid receptors modulate kinase and phosphatase activity during extinction of conditioned fear in mice[J].Learn Mem,2004,11(5):625.

[5]Schafe,GE,Atkins CM,SwankMW,et al.Activation of ERK/MAP kinase in the amygdale is required for memory consolidation of Pavlovian fear conditioning[J].J Neurosci,2000,20(21):8177.

[6]Igaz LM,Winograd M,Cammarota M,et al.Early Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinase Signaling Pathway in the Hippocampus is Required for Short-Term Memory Formation of a Fear-Motivated Learning[J].Cell Mol Neurobiol,2006,26(4-6):987.

[7]Thomas GM,Huganir RL.MAPK cascade signaling and synaptic plasticity[J].Neuroscience,2004,5:173.

[8]Bozon B,Kelly,Josselyn SA,et al.MAPK,CREB and zif268 are all required for the consolidation of recognition memory[J].Phil Trans R Soc Lond B,2003,358:805.

[9]Alkire MT,Vazdar janova A,Dickinson-Anson H et al.Lesions of the basolateral amygdala complex block propofol-induced amnesia for inhibitory avoidance learning in rats[J].Anesthesiology,2001,95(3):708.

[10]O'Gorman DA,O'Connell AW,Murphy KJ,et al.Nefiracetam prevents propofol-induced anterograde and retrograde amnesia in the rodent without compromising quality of anesthesia[J].Anesthesiology,1998,89(3):699.

[11]Veselis RA,Reinsel RA,Feshchenko VA,et al.The comparative amnestic effects of midazolam,propofol,thiopental,and fentanyl at equisedative concentrations[J].Anesthesiology,1997,87(4):749.

[12]徐叔云,卞如濂,陈 修,主编.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2005,827.

[13]Veselis RA,Reinsel RA,Feshchenko VA.Drug-induced amnesia is a separate phenomenon from sedation:electrophysiologic evidence[J].Anesthesiology,2001,95(4):896.

[14]Pain L,Angst MJ,LeGourrier L,et al.Effect of a nonsedative dose of propofol on memory for aversively loaded information in rats[J].Anesthesiology,2002,97(2):447.

[15]Trifilieff P,Herry C,Vanhoutte P,et al.Foreground contextual fearmemory consolidation requires two independent phases of hippocampal ERK/CREB activation[J].Learn Mem,2006,13:349.

[16]Silva AJ.Molecular and Cellular Cognitive Studies of the Role of Synaptic Plasticity in Memory[J].J Neurobiol,2003,54:224.

[17]Snyder GL,Galdi S,Hendrick JP,et al.General anesthetics selectively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via site-specific phosphorylation in vivo[J].Neurophamacology,2007,53(5):619.

[18]Kozinn J,Mao L,Arora A,et al.Inhibition of glutamatergic activation of extracellular signal-regulated protein kinases in hippocampal neurons by the intravenous anesthetic propofol[J].Anesthesiology,2006,105(6):1182.

[19]Kingston S,Mao L,Yang L,et al.Propofol inhibits phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunits in neurons[J].Anesthesiology,2006,104(4):763.

[20]Irifune M,Takarada T,Shimizu Y,et al.Propofol-induced anesthesia in mice is mediated by gamma-aminobutyric acid-A and excitatory amino acid receptors[J].Anesth Analg,2003,97(2):424.

[21]Nagashima K,Zorumski CF,Izumi Y.Propofol inhibits long-term potentiation but not long-term depressionin rat hippocampal slices[J].Anesthesiology,2005,103:318.

[22]Wang JQ,Fibuch EE,Mao L.Regulation of mitogen-activated protein kinases by glutamate receptors[J].Journal of Neurochemistry,2007,100:1.