白芍总苷对接触性皮炎小鼠核因子-κ B、CD1a因子、肿瘤坏死因子的影响

陈菲菲,朱晓芳,高 慧,骆 丹

(1.南京医科大学第一临床医学院,江苏南京,210009;2.扬州大学临床医学院皮肤科,江苏扬州,225001)

接触性皮炎属于与Ⅳ型变态反应,在其发病过程中,多种细胞因子、朗格汉斯细胞的活化、移动和抗原的提呈及免疫反应起到了重要的作用,其中TNF-α是主要的细胞因子,CD1a是朗格汉斯细胞的特异性标记物,皮肤免疫反应的启动与转录因子Rel/NF-κ B激活密切相关。白芍总苷是从毫白芍干燥根中提取的有效成分,现代药理学研究表明它具有抗炎、镇痛、抗应激和免疫调节等作用[1]。本研究用2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠变应性接触性皮炎(ACD)模型,观察白芍总苷对小鼠ACD的作用,通过检测耳肿度、细胞因子 TNF-α和免疫组化NF-κ Bp65、CD1a表达水平,探讨白芍总苷对小鼠ACD的作用和可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

实验用小鼠为扬州大学医学院动物中心提供的昆明小鼠32只,雌雄各半,6～8周龄,体质量25～30 g。全部小鼠随机分为4组,分别为空白组、模型组、地塞米松组和白芍总苷组,每组8只。其中空白组未做任何处理。

1.2 主要试剂

DNFB购于Sigma公司,白芍总苷(帕夫林)由宁波立华制药公司提供,地塞米松片由浙江仙琚制药股份有限公司提供,TNF-α ELISA试剂盒及NF-κ B、CD1a免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。

1.3 实验方法

1.3.1 建立小鼠ACD模型:DNFB以4∶1体积比的丙酮与橄榄油混合液为基质,配成0.2%、0.5%的2种溶液。所有小鼠于实验前1 d在腹部备皮2 cm×1.5 cm。实验第1、2天在腹部去毛部位均匀涂布0.5%的25 μ L DNFB溶液致敏。实验第6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20μ L DNFB溶液诱发皮炎。右耳涂布 20 μ L基质[2]。

1.3.2 给药方法:白芍总苷组每只小鼠用药量为1 8mg/d(小鼠用药量为成人用量20倍),溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中,每日取0.4 mL灌胃。地塞米松组每只小鼠用药量为0.09 mg/d(按成人每天地塞米松9 mg,小鼠用药量为20倍),溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中,每日取0.4 mL灌胃。模型组予以生理盐水灌胃。致敏期各组自第1次涂药前2 h开始,连续用药5 d,诱发期灌药为诱发前2 h及诱发后6 h。所有小鼠诱发后24 h处死。

1.4 观察指标

1.4.1 耳厚度差:千分尺测量小鼠双侧耳中部的厚度,计算诱发后左右耳厚度差。

1.4.2 HE染色及观察:取鼠耳组织常规石蜡切片,HE染色。观察各组的病理变化。

1.4.3 小鼠左耳皮损处组织免疫组化(SABC):观察NF-κ Bp65、CD1a的表达。切片常规脱蜡至水,3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶活性,热修复抗原,滴加5%BSA封闭液,然后依次加入一抗、生物素化二抗,SABC后,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,显微镜观察。

1.4.4 血清TNF-α检测:小鼠处死时采用眼球摘除法取血约1.5 mL,静置15 min后,3 000 r/min离心15 min,分离血清,置于-20℃冰箱中待检,采用ELISA法测定血清中细胞因子TNF-α表达水平。具体操作按试剂盒说明。用酶标仪测定各标本450 nm处OD值。以OD值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,根据标准曲线测出各样品TNF-α的浓度。

2 结 果

2.1 各组小鼠耳厚度的变化

肉眼观察,模型组小鼠左耳肿胀、充血,可见耳部血管扩张。地塞米松组及白芍总苷组小鼠左耳肿胀不明显,无明显充血。与模型组相比地塞米松组及白芍总苷组诱发后左右耳厚度差明显减小。结果表明,地塞米松及白芍总苷能有效改善耳肿胀情况。见表1。

表1 白芍总苷对ACD小鼠耳厚度差的影响( ±s,×10-3mm)

表1 白芍总苷对ACD小鼠耳厚度差的影响( ±s,×10-3mm)

与模型组比较,＊P<0.05。

组别 n 耳厚度差(左-右)空白组 8 5.425±0.537＊模型组 8 39.200±11.519白芍总苷组 8 12.000±1.000＊地塞米松组 8 10.333±2.082＊

2.2 各组组织病理学观察

模型组HE染色切片可见:表皮显示细胞间及细胞内水肿,能发现较多的单一核细胞及少数多形核细胞的浸润。真皮结缔组织水肿,血管周围可见轻度炎症细胞浸润。地塞米松组及白芍总苷组HE染色切片可见水肿消退,炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 各种处理因素对小鼠耳组织影响 HE染色,100倍

2.3 各组免疫组化检测结果

NF-κ B p65在ACD皮损角质形成细胞核周和胞浆表达,胞浆及部分胞核可见棕黄色颗粒沉着。白芍总苷组及地塞米松组NF-κ B p65表达明显减少甚至消失,空白组未见NF-κ B p65表达。见图2。CD1a在模型组中可见棕黄色深染的颗粒,在地塞米松组及白芍总苷表达组明显减少,空白组未见明显表达。见图3。

2.4 各组 TNF-α的变化(表2)

表2 各组小鼠血清中TNF-α测定( ±s,pg/mL)

表2 各组小鼠血清中TNF-α测定( ±s,pg/mL)

与模型组比较,＊P<0.05。

组别 n T NF-α空白组 8 1.865±0.492＊模型组 8 14.207±0.712白芍总苷组 8 8.000±0.497＊地塞米松组 8 6.332±0.848＊

3 讨 论

ACD是皮肤或粘膜接触致敏物后,由T细胞介导的迟发性变态反应引起的炎症性皮肤病。其中朗格汉斯细胞抗原的提呈功能起到重要的作用,CD1a是朗格汉斯细胞的标记性抗体。

角质形成细胞(KC)是参与皮肤免疫反应的重要细胞之一。各种刺激可使KC合成或产生多种生物活性分子如细胞因子及抗微生物多肽等,参与皮肤的免疫反应,而这一反应的启动与转录因子 Rel/NF-κ B 激活密切相关[3]。核因子-κ B(NF-κ B)是细胞中一个重要的核转录因子。多种刺激通过不同信号转导通路最终激活NF-κ B。NF-κ B出在免疫以及炎症反应中起着相当关键的作用[4]。激活的NF-κ B可诱导免疫细胞的多种炎症相关基因表达[3,5]、炎细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、趋化因子、协同刺激分子及粘附分子等表达,进而参与免疫炎症反应调控。研究证实,NF-κ B的活化在炎症过程中扮演了关键性角色,其活化后可启动多种促炎症基因的转录,如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环加氧酶-2(COX-2)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等[6]。

ACD主要由Th1型细胞介导,而Th2型细胞可能参与ACD的调节过程。Th1细胞主要分泌 TNF-α、IFN-γ、IL-2 等 ,而其中 TNF-α在 ACD的发病过程中发挥重要作用[7]。作为重要的炎症前介质,TNF-α可诱导炎症反应中多种细胞因子的产生、粘附分子和协同刺激因子的表达。Kataranovski等报告在ACD小鼠鼠耳皮肤培养液中TNF-α水平与耳肿胀度成正相关[8],同时TNF-α为朗格汉斯细胞移行至淋巴结提供重要的信号[9]。肿瘤坏死因子TNF-α对朗格汉斯细胞的活化、移动和抗原的提呈起重要作用[10]。

现代药理研究证实,芍药中的苷类物质(芍药总苷,TGP)是芍药的主要有效成份,可抑制大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-2,NO,产生抗炎作用[11]。

本实验结果表示,通过耳肿胀度及组织病理的变化,可以证明白芍总苷对小鼠接触性皮炎有明显的治疗作用。白芍总苷能明显降低血清中细胞因子TNF-α的水平,也明显下调了皮损组织中NF-κ Bp65、CD1a的表达。白芍总苷对小鼠接触性皮炎的免疫调节作用除了直接抑制Th1细胞相关的细胞因子 TNF-α表达外,并且能减少CD1a的表达,即对朗格汉斯细胞的抗原递呈功能起抑制作用。还可能通过直接或间接抑制KC转录因子NF-κ B的活化,从而进一步抑制NF-κ B调控的促炎细胞因子,从而对ACD起到治疗作用。

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