短发卡状RNA抑制人Bub1基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响

周婷 翁丹卉 王世宣 卢运萍 马丁

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，湖北 武汉 430030

短发卡状RNA抑制人Bub1基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响

周婷 翁丹卉 王世宣 卢运萍 马丁

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，湖北 武汉 430030

背景与目的：既往研究提示，紫杉醇类药物作用的发挥有赖于功能完整的纺锤体检查点，而Bub1是纺锤体检查点的重要组成部分。本研究旨在探讨Bub1短发卡状RNA真核表达载体稳定转染对人卵巢癌A2780细胞紫杉醇敏感性及细胞周期的影响。方法：构建Bub1基因短发卡状RNA真核表达载体pEGFP-Bub1-shRNA，以脂质体LipofectamineTM2000包裹空质粒转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780后进行稳定筛选。应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表达情况；MTT法、流式细胞术等方法检测转染前后，A2780细胞对紫杉醇敏感性及其细胞周期的变化；Hoechst33342染色法检测细胞分裂指数。结果：与对照组pEGFP-C1/A2780及A2780组相比，pEGFP-Bub1-ShRNA/A2780组细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显下降，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；MTT检测结果提示，转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后细胞对紫杉醇的敏感性明显降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；流式细胞术检测结果显示，紫杉醇1 μmol/L处理细胞24及48 h后,与pEGFP-C1/A2780及A2780组相比，该组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），G2/M期细胞比例下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Hoechst33342染色提示，与对照组相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组的分裂指数（MI）明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：Bub1基因的下调可导致人卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性及G2/M期细胞比例下降。pEGFP-C1-shBub1质粒的成功构建，为研究Bub1基因的功能及定位的研究提供了进一步的实验条件。

卵巢癌； Bub1基因； 紫杉醇； 耐药

细胞在长期的进化过程中产生的监控纺锤体形态、染色体着丝点与微管的连接及其产生的张力，确保姐妹染色单体精确分离的质控机制，即为纺锤体检查点［1］。纺锤体检查点是细胞周期的最后关卡，是近年来细胞分子生物学的研究热点。早在上世纪90年代初，研究人员就在酵母体内确定了6种执行纺锤体检查点功能所必需的基因：Bub1、Bub2、Bub3、Mad1、Mad2及Mad3，而蛋白激酶Bub1是纺锤体检查点的平台蛋白。截至目前，有关纺锤体检查点的功能尚存在较多争议，而其精细调节机制更有待于深入探讨。紫杉醇作为一线化疗药物在实体瘤包括乳腺癌及卵巢癌等恶性肿瘤的治疗方面取得了巨大成功，但临床上耐药病例仍频繁发生［2］。众所周知，紫杉醇是一种微管稳定剂，通过抑制微管解聚进而阻滞细胞周期杀伤肿瘤，而有研究提示这种杀伤作用必须有赖于具有完整功能的纺锤体检查点。虽然突变在实体瘤中并不常见，但纺锤体检查点功能低下却时有发生。Bub1是否直接影响纺锤体功能并进而导致肿瘤的化疗耐药，国内尚未见诸报道。siRNA在干扰基因表达的效率和时长均显不足，而本研究通过稳定转染pEGFPBub1-shRNA质粒，使干扰效率大为增强，且其具有更高的稳定性，为深入探讨卵巢癌细胞紫杉醇化疗耐药机制的研究提供了有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂宿主菌大肠埃希菌DH5α由华中科技大学同济医院妇科肿瘤实验室保存；质粒pEGFP-C1购自Invitrogen公司；限制性内切酶购自日本Takara公司；脂质体、G418和TRIzol购自Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）及紫杉醇购自德国Sigma公司；PCR引物由上海生物工程服务有限公司合成；抗人Bub1鼠单克隆抗体购自Chemicon公司；抗人betaactin鼠单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 人Bub1 shRNA真核表达载体的构建及鉴定对真核表达载体pEGFP-C1进行测序后分别用EcoRⅠ和MluⅠ双酶切处理，琼脂糖电泳后回收，纯化酶切产物，随后由PCR反应得到，含一个U6启动子及上述2个酶切位点的Bub1-shRNA序列（核心序列1为5’-GAGTGATCACGATTTCTAA-3’，核心序列2为5’-CCAUGGGAUUGGAACCCUGTT-3’，核心序列3为5’-CCAGGCUGAACCCAGAGAGTT-3’）以T4连接酶连接3 h，转化感受态DH5α。筛选可疑重组阳性菌株，以250 r/min（型号：Crystal, IS-RSD2）的转速，37 ℃摇菌过夜，小提质粒后用BamHⅠ和HindⅢ双酶鉴定，将获得的人Bub1重组质粒命名为pEGFP-Bub1-shRNA，并依次编号后送Invitrogen测序。

1.3 细胞培养人卵巢上皮性癌细胞株A2780购自欧洲细胞培养物收藏中心（European Collection of Cell Cultures，ECACC），来源于未经治疗的卵巢癌患者的癌变组织。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液在37 ℃、CO2体积分数为5%、相对湿度90%的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长。取对数生长期的A2780细胞接种于6孔板（细胞数为2×105个/孔）。待细胞密度为70%时，应用LipofectamineTM2000脂质体包裹pEGFP-C1空质粒和pEGFP-Bub1-shRNA 2种质粒，分别转染A2780细胞，500 mg/L G418加压筛选14 d左右得到阳性转染细胞分别命名为pEGFP-C1/A2780和pEGFP-Bub1-shRNA/A2780细胞。同时设未转染任何质粒的A2780细胞作为空白对照。

1.4 RT-PCR检测Bub1 mRNA的表达收集各组细胞，用TRIzol试剂一步法提取细胞总RNA，并用M-MLA反转录酶反转录获得cDNA；PCR扩增以cDNA为模板，以GAPDH为内参照。Bub1引物序列（459 bp）上游引物：5’-TAAACCCACAGGAGCCAGGAC-3’，下游引物：5’-CAAGCCTCAACGCCCAACT-3’；扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s， 56.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，29个循环；72 ℃终延伸10 min。GAPDH引物（250 bp）：上游引物：5’-ACGGATTTGGTC-GTATTGGG-3’；下游引物：5’-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’；扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、54 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照，每个样本至少重复3次。

1.5 Western印迹法检测各组细胞Bub1蛋白水平的差异收集细胞，提取总蛋白，取40 μg蛋白行SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白质转移至甲醇激活的PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭2 h，一抗4 ℃反应过夜，用含0.05% Tween20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相应的碱磷酶标记的二抗（1∶1 000稀释），室温条件下反应1 h，用显色底物NBT/BCIP/AP buffer （1∶1∶250）显色，以等量β-actin蛋白质作为对照，每个样本至少重复3次。

1.6 MTT法测定各组细胞对紫杉醇的敏感性取经筛选、扩大培养后的各组细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×103个/孔接种于96孔板，培养24 h后，加入不同浓度（30、90、300和1 000 nmol/L）的用相应培养液稀释的紫杉醇溶液200 μL，每一浓度设3个复孔，并设不加药物和不加细胞的对照组，继续培养48 h，每孔加1 mg/mL MTT溶液100 μL作用4 h，弃上清液，最后每孔加入DMSO 150 μL，振荡使其充分溶解，在96孔板酶标仪上测定波长为570 nm的吸光度值(A)，按下述公式计算细胞生长抑制率。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率收集经紫杉醇（1 μmol/L）作用24及48 h的各组细胞，将细胞先用冷PBS洗涤，75%乙醇于-20 ℃条件下固定过夜，洗涤细胞常规离心（1 500 r/min）15 min （Sigma，No.11030，r=15 cm），加入含有10 μg/mL PI和0.1%RNase A的PBS液500 μL，室温避光染色30 min后上流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率。

1.8 分裂指数（MI）的测定各组细胞接种于盖玻片上，1 μmol/L紫杉醇处理24 h，10 μg/mL Hoechst33342染液（Sigma Chemical Co. Louis，MO）室温染色细胞15 min后PBS洗涤，直接于荧光显微镜下观察。计数3个以上细胞数≥100的视野，MI=分裂细胞数/总细胞数×100%。

1.9 统计处理应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学处理，实验数据以表示，组间比较采用非参数检验和方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组质粒构建成功将合成退火片断与线性载体连接、转化后，挑选单克隆培养于LB培养液摇菌扩增，提取质粒DNA，BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定插入片段，确定6个克隆插入一段约360 bp的片断（含1个约300 bp的U6启动子），测序证实插入为所需片断（图1）。

图 1 人真核表达质粒pEGFP-Bub1-shRNA的酶切鉴定Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pEGFPBub1-shRNA

2.2 稳定转染克隆形成及扩大培养pEGFPBub1-shRNA和pEGFP-C1空质粒转染A2780细胞，500 mg/L G418加压筛选后，14 d可见克隆形成，随后依次转入24、12和6孔板及培养瓶中扩大培养，倒置荧光显微镜下观察细胞，95%以上的细胞发出较强的绿色荧光（图2）。

2.3 Bub1 mRNA在各组细胞中的表达凝胶电泳分析RT-PCR产物，评价各组细胞Bub1 mRNA表达的差异。由图3可见，pEGFP-C1/A2780组和A2780组细胞459 bp处条带清晰明亮，而pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组细胞在此处仅出现模糊条带，相对表达强度（Bub1/GAPDH）分别为0.42±0.03、0.45±0.02及0.11±0.03，转染组与2个对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 Western印迹法检测Bub1蛋白水平的表达获得阳性克隆后，通过Western印迹法验证3组pEGFP-Bub1-shRNA对Bub1基因的沉默效应，发现包含核心序列1的质粒具有最为明显的沉默效应，故将其命名为pEGFP-Bub1-shRNA，后续实验均以该质粒为基础进行。由图4可见，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780细胞Bub1蛋白相对表达强度（Bub1/β-actin）为0.13±0.04，而对照组pEGFP-C1/A2780和A2780细胞中的Bub1蛋白相对表达强度分别为0.58±0.03和0.60±0.02，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780细胞Bub1蛋白表达水平较其他2组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后各组细胞的紫杉醇敏感性如图5所示，pEGFPBub1-shRNA/A2780组细胞在不同浓度紫杉醇作用下的生长抑制率均明显低于pEGFP-C1/A2780细胞，2组间的差异具有统计学意义（P＜0.05），而pEGFP-C1/A2780和A2780细胞之间差异无统计学意义；同时，以紫杉醇作用24及48 h，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组细胞的凋亡率均显著低于其他2组（图6），差异均具有统计学意义（P＜0.05）；pEGFP-C1/A2780和A2780细胞的生长抑制率和凋亡率相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图 2 pEGFP-C1和pEGFP-Bub1-shRNA转染A2780细胞稳定表达Fig. 2 The stable expression of pEGFP-C1 and pEGFPBub1-shRNA plasmids transfected in A2780 cells observed by f l uorescent microscope (×40)

图 3 RT-PCR检测各组细胞Bub1 mRNA表达的琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 3 Bub1 mRNA expression in different cells by RTPCR agarose gel electrophoresis

图 4 Western印迹法检测各组细胞中Bub1蛋白的表达Fig.4 Bub1 protein expression in different cells by Western blotting

图 5 不同浓度紫杉醇处理后各组细胞的生长抑制率Fig. 5 The rates of proliferation inhibition treated with paclitaxel in different concentrations

2.6 转染Bub1后细胞周期的变化由图7可见，在紫杉醇浓度为1 μmol/L时，阻滞于G2/M期的细胞比例最高，故选用该浓度进行细胞周期的相关实验。由图8及表1可见，1 μmol/L紫杉醇处理24 h后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组细胞的G0/G1、G1/S及G2/M期细胞的比例分别为（37.1±3.2）%、（24.6±4.4）%和（38.7±2.2）%，而转染空质粒组相应的比例为（13.3±1.6）%、（14.2±2.3）%和（73.4±5.8）%。由以上数据可以看出，转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后，G2/M期细胞比例明显降低，2组间差异有统计学意义（P＜0.05）；而S期细胞比例增加，2组间差异亦具有统计学意义（P＜0.05）。pEGFP-C1/A2780组与A2780组之间则差异无统计学意义（P＞0.05）。

图 6 紫杉醇处理后不同时间点各组细胞凋亡率Fig. 6 The rate of apoptotic cells in different groups treated with paclitaxel for different hours

2.7 分裂指数1 μmol/L紫杉醇处理各组细胞24 h，pEGFP-C1/A2780组的分裂指数为（77.8±5.8）%，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组为（33.6±5.8）%，2组间差异有统计学意义（P＜0.05）。而pEGFP-C1/A2780与A2780组之间的差异则无统计学意义（P＞0.05）。

图 7 A2780细胞经不同浓度紫杉醇处理24 h后的G2/M期细胞比例Fig. 7 The rates of G2/M phase A2780 cells treated with paclitaxel by different concentrations for 24 h

图 8 流式细胞术检测细胞周期的变化Fig. 8 Detection of the diversity of growth phase by f l ow cytometry

表 1 紫杉醇处理24 h后各组细胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

表 1 紫杉醇处理24 h后各组细胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

*: P＜0.05, compared with pEGFP-C1/A2780.

Cell cycle G0/G1 S G2/M A2780 12.6±1.5 17.9±2.4 71.4±6.7 pEGFP-C1/A2780 13.3±1.6 14.2±2.3 73.4±5.8 pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 37.1±3.2* 24.6±4.4* 38.7±2.2*Group

3 讨 论

化疗是治疗中、晚期卵巢癌综合治疗必需的手段之一。虽然在接受传统治疗的初期，卵巢癌对化疗药物的反应较为敏感，但因为易产生耐药，故而远期疗效欠佳。有研究提示，紫杉醇类药物发挥作用须依赖于功能完整的纺锤体检查点［3］，有缺陷的纺锤体检查点不能将细胞阻滞于G2/M期进而减少细胞凋亡。纺锤体检查点，是指细胞在长期的进化过程中产生的一套监控纺锤体形态、染色体排列、染色体着丝粒与微管联接及其张力、确保姐妹染色单体精确分离的质控机制［4］。Bub1既是后期促进复合体APC的抑制剂［5］，亦是其底物。Bub1对于Bub3、BubR1及Mad2等纺锤体组分均具有调控作用［6］，是纺锤体信号转导和染色体排列所必需的［7］。广泛的临床样本检测提示纺锤体检查点基因突变在实体瘤中较罕见［8］，但另一方面，蛋白水平异常导致的纺锤体检查点功能缺陷却时有发生。Shichiri等［9］发现：在结直肠癌组织中，Bub1表达水平明显高于邻近的正常组织。Grabsch等［10］的研究结果提示，胃癌组织Bub1 mRNA显著高表达，且其表达水平与肿瘤细胞的增殖呈相关关系。国内亦有关于Bub1表达的研究，如李刚强等［11］就通过免疫组织化学检测发现：Bubl蛋白的表达水平与乳腺癌复发密切相关。

本研究运用小RNA干扰技术特异性干扰人卵巢癌细胞A2780中Bub1 mRNA及蛋白表达水平，随后用不同浓度的紫杉醇进行处理，MTT结果提示：Bub1基因的下调能导致A2780细胞紫杉醇敏感性的降低，而这与既往研究结果相一致［12］。此后，通过流式细胞分析，本研究发现：紫杉醇处理24 h后，与对照组相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780组G2/M期细胞比例显著降低，而G0/G1及S期细胞比例增加。同时，Hoechst33342染色结果提示：在转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后，紫杉醇处理24 h，细胞分裂指数明显降低，该实验为上述细胞周期分析提供佐证。以上2个实验证明，在沉默Bub1基因后，被阻滞于G2/M期的细胞明显减少。当转染pEGFP-Bub1-shRNA质粒后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780细胞的凋亡率也相应降低。由此，笔者推测是由于Bub1基因表达下调使纺锤体检查点失活，进而导致在紫杉醇作用时，阻滞于G2/M期的细胞减少，成功逃逸G2/M期阻滞的这群细胞继续进入周期循环中而得以存活。

纺锤体检查点功能缺陷在肿瘤发生发展中的确切作用及其组分对恶性肿瘤微管抑制剂敏感性的影响，需要科研工作者对纺锤体检查点进行深入细致的研究。只有深入了解肿瘤细胞内在的抵御机制，才能充分发挥药物的杀伤作用，最终为人类恶性肿瘤的防治提供新的策略。

［1］傅云峰, 谢幸, 叶大风. 肿瘤与纺锤体检查点的研究现状［J］. 国外医学·肿瘤学分册, 2005, 32(1): 3-6.

［2］Bergstralh DT, Ting JPY. Microtubule stabilizing agents:their molecular signaling consequences and the potential for enhancement by drug combination ［J］. Cancer Treat Rev,2006, 32(3): 166-179.

［3］Sudo T, Nitta M, Saya H, et al. Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint ［J］.Cancer Res, 2004, 64(7): 2502-2508.

［4］Wassmann K, Benezra R. Mitotic checkpoints: from yeast to cancer ［J］. Curr Opin Genet Dev, 2001, 11(1): 83-90.

［5］Tang Z, Shu H, Oncel D, et al. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint ［J］. Mol Cell, 2004, 16(3): 387-397.

［6］Bharadwaj R, Yu H. The spindle checkpoint, aneuploidy, and cancer ［J］. Oncogene, 2004, 23(11): 2016-2027.

［7］Klebig C, Korinth D, Meraldi P. Bub1 regulates chromosome segregation in a kinetochore-independent manner ［J］. J Cell Biol, 2009, 185(5): 841-858.

［8］Lopes CS, Sunkel CE. The spindle checkpoint: from normal cell division to tumorigenesis ［J］. Arch Med Res, 2003,34(3): 155-165.

［9］Shichiri M, Yoshinaga K, Hisatomi H, et al. Genetic and epigenetic inactivation of mitotic checkpoint genes hBUB1 and hBUBR1 and their relationship to survival ［J］. Cancer Res, 2002, 62(1): 13-17.

［10］Grabsch H, Takeno S, Parsons WJ, et al. Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1, BUBR1, and BUB3 in gastric cancer-association with tumour cell proliferation ［J］. J Pathol, 2003, 200(1): 16-22.

［11］李刚强, 周海亚, 朱瑞. 乳腺癌组织中Bub1和p53的表达与意义［J］. 中华肿瘤防治杂志, 2007, 14(9): 683-685.

［12］Schliekelman M, Cowley DO, O’Quinn R, et al. Impaired Bub1 function in vivo compromises tension-dependent checkpoint function leading to aneuploidy and tumorigenesis ［J］.Cancer Res, 2009, 69(1): 45-54.

Effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid on cell cycle and paclitaxel -sensitivity in human ovarian cancer ceIl line A2780

ZHOU Ting,WENG Dan-hui,WANG Shi-xuan,LU Yun-ping,MA Ding(Department of Department of Obstetrics and Gynecology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei, 430030, China)

WANG Shi-xuan E-mail：sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

Background and purpose：Previous studies have shown that Bub1 was a critical component of the spindle checkpoint. Paclitaxel sensitivity was considered to be dependent on the functionality of this spindle checkpoint. This study investigated the effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid stably transfected into the cell cycle and its sensitivity in human ovarian cancer cell line A2780.Methods：After the pEGFP-Bub1-shRNA plasmid and empty plasmids were constructed, they were transfected into A2780 cells by the Lipofectamine 2000TM. The nontransfected cells were the control. RT-PCR and Western blotting were used to determine the target gene and protein expression. The rate of proliferation inhibition was tested by an MTT assay, apoptosis and cell cycles were determined by flow cytometry, and the mitotic index was determined by Hoechst33342 dye.Results：RT-PCR and Western blotting showed that pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group displayed a low expression of Bub1 compared to the A2780 and pEGFP-C1/A2780 group (P＜0.05). The sensitivity of the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group was significantly lower than the non-transfected and pEGFP-C1/A2780 cells (P＜0.05). Flow cytometry revealed that the rates of G2/M phase and apoptosis were significantly lower in the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group than those in the control group(P＜0.05).Conclusion：Bub1 plays an important role in the paclitaxel treatment. A down-regulation of Bub1 could reduce the drug sensitivity and rate of G2/M cells in human ovarian cancer cell line A2780.

ovarian cancer; Bub1; paclitaxel; resistance

R73-36+1

A

1007-3639(2010)03-0161-06

国家海外青年学者合作研究基金项目（项目编号：30528012）；国家973重点基础研究发展计划资助项目（项目编号：2009CB521800）。

王世宣 E-mail:sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

2009-12-10

2010-02-01）