DKK3和vWF在结直肠癌组织中的表达及临床意义

牛云霞 王晨昱 杨爱军 刘伟 尚丽娜 李敏 王金穗

1.兰州大学病理研究所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院病理科，甘肃 兰州 730000

DKK3（dickkopf homolog 3 gene）目前被认为是一种抑癌基因［1］，其表达的蛋白是Wnt信号通路的抑制剂。DKK3在人类的多种肿瘤组织和细胞株中表达减弱或消失，包括前列腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和肺癌等［2-6］。同时有文献报道肿瘤间质血管表达DKK3［7］。血管性血友病因子（vWF） 是一种由血管内皮细胞和巨核细胞合成和释放的大分子糖蛋白，本课题组以往的研究发现肺癌、胃癌细胞株都表达少量vWF，vWF与肿瘤细胞黏附、侵袭、迁移相关。 本研究利用组织芯片技术制作结直肠癌组织芯片，应用免疫组织化学方法检测DKK3、vWF在结直肠癌中的表达，对两者与MVD和两者之间相关性及临床意义进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集经甘肃省人民医院病理科2008年6月—2009年月期间确诊的94例结直肠癌患者的手术切除标本，所有标本用10%甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋。其中男性56例，女性38例，男女比例为1.473∶1，年龄27～80岁，中位年龄56岁。所有病例根据2000年版WHO《Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System》［8］标准进行组织学分型和病理分级，归类如下：⑴按组织学类型分，Ⅰ级，高分化管状和乳头状腺癌1例；Ⅱ级，中分化腺癌68例；Ⅲ级，低分化腺癌和印戒细胞癌26例。⑵按部位分，结肠癌16例，直肠癌78例。⑶按有无淋巴结转移分，有转移的42例，无转移的52例。所有患者术前均未接受化疗或放射治疗。另取31例结直肠癌组织5 cm以上的正常肠黏膜组织作为对照。

1.2 方法

1.2.1 结直肠癌组织芯片的制备 采用组织芯片制作仪制作组织芯片，首先制作模板蜡块，在模板上用组织阵列仪打出直径为2 mm的孔，然后在光学显微镜下观察HE染色后的病理切片，对照相应蜡块选取典型癌组织区域，用组织微阵列仪获取直径为2 mm的柱形组织，放入模板蜡块已打好的孔里，表面压平。相邻孔间距为1 mm，按标本编号排列，每个组织共制作5个组织芯片蜡块。将组织芯片蜡块以4～6 μm厚连续切片，敷贴于用1%多聚赖氨酸溶液处理后的载玻片上，分别进行HE染色及免疫组织化学染色检测。

1.2.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法。鼠抗人DKK3单克隆抗体（浓缩型，进口分装）购自上海蓝基生物有限公司；兔抗人vWF多克隆抗体（即用型，进口分装）、CD31单克隆抗体（即用型）、超敏 SP鼠抗兔试剂盒（即用型）、DAB显色液均购自北京中杉生物技术公司。操作严格按照超敏SP鼠抗兔试剂盒所附说明书进行。用试剂公司附赠的阳性片子作为阳性对照， PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 DKK3蛋白为细胞核着色，vWF蛋白阳性染色定位于细胞质，出现棕黄色颗粒者为阳性。于光学显微镜（400倍）视野下随机选取3个有代表性的不同区域，每个视野的得分由细胞染色强度和染色细胞所占面积两者计分之和来判断。染色强度计分为：不染色=0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3；染色面积计分为：无细胞染色=0，＜25%细胞染色=1，25%～50%细胞染色=2，＞50%细胞染色=3。若2种计分之和＞2，则为阳性表达，≤2则为阴性表达。（-）为阴性，（+）为弱阳性表达，（++）～（+++）为强阳性表达。

微血管密度（microvascular density，MVD）的判断采用CD31抗单克隆抗体标记血管内皮细胞，计数单位面积中的MVD可由此来衡量肿瘤血管的活跃程度。阳性表达主要为血管内皮细胞的细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒状。先在低倍光学显微镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，然后在400 倍视野下计数上述3个不同区域的血管数，取其平均值作为MVD。

1.4 统计处理 采用SPSS 11.5统计软件包进行统计处理。用Pearson Chi-Square检验分析DKK3及vWF与结直肠癌生长方式、组织学类型及淋巴结转移间的相互关系。DKK3和vWF在结直肠癌中表达的相关性采用Spearman 等级相关分析。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DKK3在结直肠癌组织及癌旁黏膜中的表达 DKK3在结直肠癌细胞核中表达，大多表达减弱或缺失；而癌旁黏膜中呈阳性表达，间质血管内皮细胞中不表达DKK3。DKK3在结直肠癌中总的阳性表达率为57.45%（54/94）。癌组织中DKK3的阳性表达较正常肠黏膜组织降低或缺失，差异有统计学意义（P＜0.05，图1，表1～2）。

2.2 vWF在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达 vWF表达位于结直肠癌细胞质，在结直肠癌的癌旁黏膜均未见阳性表达。vWF在结直肠癌中总的阳性表达率为27.66%（26/94）。vWF在癌旁黏膜与结直肠癌中的表达相比，差异有统计学意义（P＜0.05；图1，表1～2）。

2.3 结直肠癌中DKK3，vWF蛋白的表达与MVD的关系 以CD31为标记检测MVD，统计分析结果显示，DKK3和vWF的表达与MVD无相关性（P值分别为0.110和0.937，表3）。

2.4 DKK3与vWF在结直肠癌组织中的表达的相关性分析 94例结直肠癌患者中DKK3低表达而vWF阳性表达的表达率为9.57%（9/94），进行Spearman等级相关分析显示DKK3低表达和vWF高表达在结直肠癌中的表达无相关性（r=0.1310，P=0.2090）。

图1 DKK3及vWF在结直肠癌和癌旁黏膜中的表达Fig.1 DKK3 and vWF expression in colorectal carcinoma and para-cancer mucosa

表1 DKK3和vWF表达与结直肠癌临床病理特征之间的关系Tab.1 Relationship between DKK3 and vWF expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(n)

表2 DKK3和vWF在结直肠癌及癌旁黏膜中的表达Tab.2 DKK3 and vWF expression in colorectal carcinoma and Para-cancer mucosa(n)

表3 DKK3，vWF与MVD的关系Tab.3 Relationship between expression of DKK3 and vWF and MVD

3 讨 论

DKKs基因是近几年发现的编码分泌性Wnt拮抗剂的基因家族，其成员DKK3基因与同族其他成员性质差别较大，所有的DKK蛋白在调节上皮间质转化的组织中有明显的表达增加，Dickkopf（DKK）家族包括4个基因（DKK1～DKK14）和一个DKK3相关基因-soggy（sgy）或DKK1L。DKK蛋白（Dickkopf蛋白）是由255～350个氨基酸构成的分泌性糖蛋白［9］。

尽管关于DKKs家族的报道较多，但对DKK3基因的研究尚较少，其生物学作用不清楚。本研究发现结直肠黏膜隐窝上皮表达DKK3蛋白，这与Zitt等［10］的研究不同，但与Sato等［4］的研究结果相同；结直肠癌中DKK3表达下降或缺失，DKK3的表达与患者的分化程度、淋巴结转移有关：分化越低，没有淋巴结转移，DKK3表达就越低、甚至缺失，这些说明DKK3基因可能是一个抑癌基因，能够抑制肿瘤的侵袭和转移；同时肿瘤间质血管不表达DKK3蛋白，结直肠癌中DKK3的表达与MVD无相关性。而Untergasser等［7］发现DKK3在恶性黑色素瘤、脑胶质瘤及结直肠癌等富含血管的肿瘤中，间质血管表达DKK3，同时DKK3的表达和MVD成正相关关系，能够促进内皮祖细胞血管换的形成。本研究与Untergasser等［7］和Zitt等［10］的研究不同，这可能与本研究病例太少或DKK3在间质血管中的表达在蛋白水平太少或没有意义有关，是否在mRNA水平有差异，待用免疫荧光做进一步的研究探讨。St Croix等［11］曾报道检测人类肿瘤内皮细胞中基因的变异，DKK3基因就是其中之一。

本研究发现vWF除了由血管内皮细胞和巨核细胞分泌外，结直肠癌细胞自身也可以分泌vWF，其阳性表达与结直肠癌的淋巴结转移相关。伴有淋巴结转移的患者，vWF的阳性表达率高，这说明vWF与结直肠癌的转移有关，本研究先前在胃癌、肺癌细胞水平上发现vWF能够促进肿瘤细胞的黏附、侵袭和迁移。由于vWF可在血管内皮细胞中表达，所以在有淋巴结转移结直肠癌中，vWF表达的增多可能缘于MVD增加，然而对94例样本进行统计，发现MVD与vWF表达之间并无相关性。表明在有淋巴结转移的结直肠癌中vWF表达的增多与MVD无相关性，主要是由于肿瘤细胞产生的。MVD和vWF表达无相关性，可能因为vWF的表达受血管类型、组织微环境等多样因素的影响。

本研究显示，DKK3和vWF在结直肠癌中的表达无相关性（r=0.1310，P=0.2090），而与MVD无相关性，可能提示两者是在结直肠癌的不同发生发展阶段起作用。由此可见，DKK3低表达和vWF高表达在结直肠癌的转移中有重要作用，提示可能是一种治疗结直肠癌的新靶点。

［1］ KHsieh SY, Hsieh PS, Chiu CT, et al.Dickkopf-3/REIC functions as a suppressor gene of tumor growth［J］.Oncogene, 2004, 23(57)： 9183-9189.

［2］ Zenzmaier C, Untergasser G, Hermann M, et al.Dysregulation of Dkk-3 expression in benign and malignant prostatic tissue［J］.Prostate, 2008, 68(5)： 540-547.

［3］ Lee EJ, Jo M, Rho SB, et al.Dkk3, downregulated in cervical cancer, functions as a negative regulator of β-catenin［J］.Int J Cancer, 2009, 124(2)： 287-297.

［4］ Sato H, Suzuki H, Toyota M, et al.Frequent epigenetic inactivation of Dickkopf family genes in human gastrointestinal tumors［J］.Carcinogenesis, 2007, 28(12)： 2459-2466.

［5］ Kobayashi T, Sakaguchi M, Tanimoto R, et al.Mechanistic analysis of resistance to REIC/Dkk-3-induced apoptosis in human bladder cancer cells［J］.Acta Medica Okayama,2008, 62(6)： 393-401.

［6］ Yue W, Sun Q, Dacic S, et al.Downregulation of Dkk3 activates β-catenin/TCF-4 signaling in lung cancer［J］.Carcinogenesis, 2008, 29(1)： 84-92.

［7］ Untergasser G, Steurer M, Zimmermann M, et al.The Dickkopf-homolog 3 is expressed in tumor endothelial cells and supports capillary formation［J］.Int J Cancer, 2008,122(7)： 1539-1547.

［8］ Stanley R, Hamilton, Lauri A, et al.World Health Organization classification of tumours.Pathology and genetics of tumours of the digestive system ［M］.Lyon： IARC Press, 2000： 103-142.

［9］ Niehrs C.Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators［J］.Oncogene, 2006, 25(57)： 7469-7481.

［10］ Zitt M, Untergasser G, Amberger A, et al.Dickkopf-3 as a new potential marker for neoangiogenesis in colorectal cancer：Expression in cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue［J］.Dis Markers, 2008, 24(2)： 101-109.

［11］ St Croix B, Rago C, Velculescu V, et al.Genes expressed in human tumor endothelium［J］, Science, 2000, 289(5482)：1197-1202.