以硫代葡萄糖苷相对含量优选莱菔子炮制工艺研究

任 涛， 吕文海

（山东中医药大学，山东济南 250355）

以硫代葡萄糖苷相对含量优选莱菔子炮制工艺研究

任 涛， 吕文海*

（山东中医药大学，山东济南 250355）

莱菔子；炮制工艺；硫代葡萄糖苷；HPLC；内标法

目的：采用均匀设计优化莱菔子的炮制工艺。方法：为了比较莱菔子清炒前后质量变化，选择烯丙基硫苷作为内标，计算用HPLC法测定供试品中硫苷的相对含量，优选炒制工艺参数。结果：随着炒制时间延长，莱菔子中硫苷含量会逐渐降低。在炒制温度200～250℃，炒制时间1～1.5 min时，硫苷含量达到最大，是生品含量的4.2倍。结论：实验证明优选出的炒莱菔子工艺，有利于硫苷类成分的保存。

莱菔子为中医常用消食药，具“生升熟降”的药性特点。生品能升能散，长于涌吐风痰；炒后性转沉降，有香气，可避免生品服后恶心呕吐的不良反应，并长于消食除胀、降气化痰［1］。目前中医临床中主要应用炒莱菔子。

在探讨莱菔子炮制机理过程中，认识到其“生升熟降”、“生熟异治”的药性特点与饮片炮制和服用方法密切相关。经生、炒莱菔子饮片的系统对比分析，在其气味、挥发性部位中找到了相应的区别成分［2］。在对水溶性部位的系统对比分析中，证实炒制可抑制莱菔子中芥子酶的活性，防止所含的硫代葡萄糖苷（简称硫苷）类成分在煎煮过程中酶解为莱菔子素等，并阻止其进一步生成新的含硫次生产物，从而减弱对消化道运动促进作用的活性（另文发表）。

参照文献方法，经甲醇提取，沉淀蛋白，酸性氧化铝柱分离，从莱菔子中得到黄褐色半固体物，经HPLC/MS分析，观察到硫苷特征峰［M—K］-，在MS2质谱中所有硫苷都产生m/z 75和m/z 97的碎片峰，分别是［S=C=N—OH］-和［—HSO4］离子。另外还观察到了和硫苷侧链有关的［R—（C=NOH）—S-离子。定性地证明了所提部位含硫苷类成分。并证实炒莱菔子中硫苷含量远高于生莱菔子。药理实验证明，莱菔子硫苷溶液有显著的促进小鼠肠推进的作用，可改善因阿托品引起的肠道平滑肌抑制作用，也有一定程度的抑制小鼠胃排空的作用，说明硫苷类成分有可能是反应莱菔子生、炒品药效区别的成分之一（另文发表）。莱菔子中的硫苷含量有望成为反映其生、炒品及炮制程度的专属性指标。在尚未分离到莱菔子中硫苷对照品的情况下，本实验以烯丙基硫苷（Allyl group glucosinolate）为内标物，以HPLC图谱中莱菔子硫苷与内标物峰面积之比为指标，通过均匀设计，比较了莱菔子不同炮制品中的硫苷相对含量并优选了其炮制工艺。

1 实验材料

1.1 供试饮片 莱菔子，购于鄄城良海中药饮片有限公司，经山东中医药大学药学院生药系周凤琴教授鉴定为十字花科植物萝卜Raphanus sativus L.的干燥成熟种子。按前期研究确定的净制工艺净选，作为生莱菔子备用。

炒莱菔子，取净莱菔子，用“莱菔子炮制工艺与质量标准的规范化研究”中确定的工艺炒至质地鼓起，易脱皮，富油性并有爆裂声和特有香气溢出时，取出，晾凉。生、炒品均粉碎成粗粉备用。

1.2 仪器与试剂 高效液相色谱仪 Agilent1100（美国安捷伦科技有限公司），非接触式红外测温仪（AR872D）。

乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。烯丙基硫苷（Allyl group glucosinolate）对照品购于中国农业科学院油料作物研究所。

2 方法与结果

2.1 供试饮片的制备 在饮片生产中，种子类药物主用滚筒式炒药机炮制，对具体品种而言，生产时的投药量、炒药机转速为固定值。炒制温度和时间是需要优选的工艺参数。实验选用非接触式红外测温仪（AR872D）结合煤气炉调控火力，控制炒莱菔子时的锅底温度，通过秒表控制时间。对供试莱菔子样品进行了均匀试验设计。

2.1.1 均匀试验设计 在“莱菔子炮制工艺与质量标准的规范化研究”的基础上，经进一步预试，选用U6（6×3）混和水平均匀设计表［3］设计试验，见表1。

2.1.2 供试样品的制备 取净莱菔子6份，每份500 g，按表1的6种工艺组合，投料，炒制，放凉，塑料袋密封，备用。结果见表2。

2.2 硫苷相对含量测定方法的建立

2.2.1 内标物的选择 参照文献［4］，对烯丙基硫苷作莱菔子硫苷相对含量测定内标物的可行性进行了考察。按2.2.2项和2.2.3项制备浓度为0.379

表1 莱菔子炒制工艺因素水平表

表2 莱菔子样品炒制结果

mg/mL烯丙基硫苷对照样品与莱菔子供试样品，并在莱菔子供试样品中加入定量烯丙基硫苷，按2.2.4项色谱条件进样。结果表明，烯丙基硫苷与莱菔子中所含硫苷在HPLC谱图中保留时间接近且能达到基线分离，见图1～3；用 Agilent1100色谱工作站对其进行紫外全波长扫描，证实二者均在225 nm处有最大吸收。证明烯丙基硫苷可以作为莱菔子中硫苷含量测定的内标物。

图1 烯丙基硫苷对照品HPLC图谱

图2 莱菔子中硫苷样品HPLC图谱

2.2.2 内标物样品溶液的制备 取烯丙基硫苷对照品，精密称定。配制成浓度为 0.433、0.379、0.325、0.217、0.108、0.027 1 mg/mL 的内标物样品溶液。

图3 莱菔子中硫苷加烯丙基硫苷内标样品HPLC图谱

2.2.3 供试品溶液的制备 取炒莱菔子粉末0.2 g，精密称定。置50 mL烧瓶中，精密加水25 mL，称重。回流提取1.0 h，补足失重，抽滤，0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.2.4 色谱条件的选择 色谱柱：Phenomenex-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1% 磷酸水溶液（5∶95）；检测波长：225 nm；参比波长：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.2.5 线性关系考察

2.2.5.1 内标物线性关系考察 用2.2.2项烯丙基硫苷内标物溶液，按2.2.4项下色谱条件测定，以峰面积（Y）对烯丙基硫苷的浓度（X）进行线性回归，得回归方程为 Y=18 821X+95.148（r=0.999 7）。实验表明烯丙基硫苷浓度在0.027 1 mg/mL～0.433 mg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.2.5.2 样品与内标物峰面积比值与样品含量线性关系考察 取炒莱菔子粉末1.6 g，精密称定。置250 mL烧瓶中，精密加水100 mL，称重。回流1.0 h，补足失重，抽滤，分别精密量取滤液 10、8、6、4、2、1 mL置10 mL量瓶中，用水定容至刻度。过0.45 μm微孔滤膜。各供试样品分别与浓度为0.433 mg/mL的内标物溶液按1∶1均匀混合，照2.2.4项色谱条件进样，计算出样品硫苷峰面积/内标物峰面积的比值，以及供试样品取样量（mL）/10的比值，对两个比值进行线性回归，得回归方程为 Y=1.905 6X+0.006 8（r=0.999 9），实验表明样品硫苷与内标物硫苷的峰面积比与样品中硫苷含量呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度考察 取炒莱菔子粉末0.2 g，精密称定。按2.2.3项制备供试品溶液，连续进样5次，与浓度为0.433 mg/mL的内标物溶液峰面积相比，结果峰面积比分别为 0.901、0.902、0.906、0.902、0.898，平均值为0.918，RSD为0.29%，表明方法精密度良好。

2.2.7 稳定性考察 取炒莱菔子粉末0.2 g，精密称定。按2.2.3项制备供试品溶液，分别于0、0.5、1、2、4、8 h时按2.2.4项下色谱条件进样，计算莱菔子中硫苷与0.433 mg/mL烯丙基硫苷内标物峰面积比分别为：0.944、0.964、0.961、0.959、0.964、0.965，平均值为0.959，RSD为0.79%，表明供试品溶液在制备后8 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性考察 取5份炒莱菔子粉末0.2 g，精密称定。按2.2.3项制备供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件进样，计算莱菔子中硫苷与0.433 mg/mL烯丙基硫苷内标物峰面积比分别为：0.971、0.924、0.941、0.943、0.913，平均值为 0.939，RSD为2.19%，表明方法的重复性良好。

2.3 供试饮片硫苷相对含量测定及工艺优选 精密称取2.1.2项下制备的6份样品按得率换算成原药材各0.2 g，按2.2.3项制备样品及0号生品，按2.2.4项下色谱条件进样，莱菔子中硫苷与烯丙基硫苷峰面积比的平均值，结果见表3。

表3 供试饮片中硫苷相对含量结果（n=3）

实验数据（不含0号）借助Uniform Design version 2.10进行多元回归分析，得回归方程：Y=1.188-0.196 9X（1），方程显著性检验：检验值Ft=50.48，临界值 F（0.05，1，4）=7.709，Ft＞ F（0.05，1，4），回归方程显著。

其中方程项［X（1）］炒制时间进行显著性检验：检验值 F（1）=50.48，临界值 F（0.05，1，4）=7.709，F（1）＞F（0.05，1，4），此方程项显著；方程项［X（2）］投药温度，在200～300℃时对回归贡献小，对其进行显著性检验，检验值F（2）=5.855×10-2，临界值 F（0.05，1，3）=10.13，F（2）≤F（0.05，1，3），此方程项不显著，剔除。

自动试验条件结果表明，当投药时锅底温度在200～300℃时，最优炒制时间为1 min，预期指标最大值为0.991 6（±0.113 6）。

分析结果表明，莱菔子炒制得当，其硫苷相对含量是生品的4.2倍。炒制时间在1.0～3.5 min，投药时锅底温度在200～300℃范围内，温度对莱菔子炒制工艺影响不显著，决定炒莱菔子质量的主要因素是炒制时间，随着时间延长，硫苷的含量逐渐降低，结合实际操作，确定炒莱菔子最佳炒制工艺范围为：炒制时间1～1.5 min，投药时锅底温度在200～250℃。这与传统炮制中，莱菔子须急火快炒的经验相一致。

2.4 验证优选工艺 按照优选的最佳工艺范围，做3份验证性试验，依2.2项下建立的方法测定，得峰面积比平均值为：0.948，RSD为1.06%，与预期最大值接近，表明优选结果可信。

3 小结与讨论

3.1 结合前期工作综合分析，笔者认为炒莱菔子饮片中硫苷含量的高低是反映其炮制品质量的重要专属性指标。在尚未获得莱菔子中硫苷对照品的前提下，以烯丙基硫苷为内标物，建立了莱菔子饮片中硫苷相对含量的测定方法，经方法学考察，证明其稳定可靠，可以反映不同炮制条件下莱菔子饮片中硫苷的相对含量。实验中以样品硫苷与内标物烯丙基硫苷的峰面积比优选炮制工艺，有效地减少了实验误差。本文为在没有专属对照品条件下，借用内标物，对饮片药效成分相对含量测定在方法学上进行了有益的探索，为类似研究提供了有益的借鉴。

3.2 通过均匀设计优选出的炮制工艺，其成品性状与传统优质炮制品在外观性状上具有高度相似性。其硫苷相对含量是生品的4.2倍，证实炒制得当，可显著提高莱菔子中硫苷含量。实验证实，高温长时间条件下的炒过品硫苷含量大幅下降，表面炭化的样品中硫苷几乎损失殆尽，证实了莱菔子传统炮制中“火候”的科学性。鉴于莱菔子饮片在品种、含水量、外观色泽、大小等性状方面存有一定差异，炮制机械在规格、性能等方面尚不统一。其优选出的炮制工艺参数，只能是一个范围。生产中要针对特定设备，建立科学的模拟实验，试验出适应特定设备并符合所选工艺参数范围的具体条件，才能实现优选工艺条件的客观化。这在中药炮制行业具有一定的普遍性。生产中对样品最佳炮制性状的判断仍具有较强的经验性。中药炮制研究中必须正视这一行业特点，防止炮制工艺研究中的简单化。

3.3 莱菔子炒制可显著提高其硫苷相对含量。为进一步建立莱菔子中硫代葡萄糖苷类成分的含量的测定方法，对莱菔子中代表性硫苷成分的分离纯化工作正在进行中。

［1］龚千锋.中药炮制学［M］.北京：中国中医药出版社，2005：109.

［2］张 欣，王爱武，宿廷敏，等.莱菔子生制品挥发性成分GC-MS分析［J］.中成药，2008，30（1）：96-98.

［3］李 宏.莱菔子现代研究概况［J］.北京中医药大学学报，2001，24（3）：67.

［4］彭爱娟，唐桂芬，兰尊海，等.反相离子对色谱法测定油菜籽（饼）中的硫苷［J］.色谱，2000，18（1）：85-87.

Processing of Semen raphani based on glucosinolate content

REN Tao， LÜ Wen-hai*
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Semen raphani；processing technology；glucosinolates；HPLC；internal standard method

AIM：To optimize the processing parameters of Semen raphani by uniform design.METHODS：In order to compare the change of Semen raphani in quality before and after simple stir-frying，allyl glucosinolate was selected as the internal standard.The relative content of glucosinolate was determined by HPLC and the processing parameters were optimized.RESULTS：The glucosinolate content gradually decreased as the processing time increased，maxima in HPLC peak area appeared at 200-250℃ and in the range of 1-1.5 min and the content of glucosinolate in the processed Semen rahani was 4.2 times as great as that in the non-stir-frying.CONCLUSION：It shows that the optimized processing of Semen raphami is beneficial for the conservation of glucosinolates.

R283

A

1001-1528（2010）07-1159-04

2009-09-10

国家自然科学基金资助项目（30672665）

任 涛（1984-），男，硕士研究生，从事中药炮制研究。Tel：13658611056 E-mail：rentao-sd@163.com

*通讯作者：吕文海，教授，研究方向：饮片炮制理论与制备规范化。E-mail：luwenhaitcm@163.com