金刺参九正合剂HPLC指纹图谱研究

孙冬梅， 毕晓黎， 庄玉坚

（广东省中医研究所，广东广州 510095）

金刺参九正合剂HPLC指纹图谱研究

孙冬梅， 毕晓黎， 庄玉坚

（广东省中医研究所，广东广州 510095）

金刺参九正合剂；HPLC；指纹图谱

目的：采用高效液相色谱法建立金刺参九正合剂（金荞麦、刺梨、苦参）的指纹图谱。方法：以Agilent Zorbax Extend-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）为流动相梯度洗脱，流速0.7 mL/min；柱温25℃；检测波长220 nm。结果：以儿茶素峰为参照物峰，确定13个共有峰，共有峰面积之和大于95%。结论：建立的方法操作简便，精密度、稳定性和重复性好，为该制剂的质量控制提供了方法。

金刺参九正合剂（原爱福宁合剂）是在贵州苗族民间验方的基础上以刺梨、苦参、金荞麦配伍组方，采用现代生物工程技术处理精制而成的新一代抗癌药物，具有清热解毒、健脾生津、燥湿和胃之功，临床作为肿瘤治疗的辅助药，取得较好疗效［1］。原质量标准仅对制剂中苦参碱的含量进行控制，并不能表征全方内在质量。为了更高地控制制剂质量，并为其物质基础研究提供依据，对金刺参九正合剂进行指纹图谱研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD检测器，四元梯度泵，G2171BA数据处理系统。HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯（Merk），水为屈臣氏蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

儿茶素（批号：877-200001）购于中国药品生物制品检定所；苦参、金荞麦、刺梨汁药材及金刺参九正合剂共10批（20080107、20080108、20080109、20080201、20080202、20080203、20080301、20080302、20080501、20080502）均由贵州老来福医药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流动相：乙腈（A）-水（含 0.3% 磷酸及 0.2%三乙胺）（B），采用梯度洗脱，A相梯度：0～10 min，1% ～1%；10～20 min，1% ～10%；20～40 min，10% ～30%；40～55 min，30% ～40%；检测波长：220 nm；流速：0.7 mL/min；柱温：25 ℃；运行时间：55 min；进样量：7 μL。

2.2 参照峰的选择 儿茶素（10号峰）为本方有效成分之一，在HPLC图谱中峰面积较大，出峰时间适中且稳定，故选择儿茶素为参照峰。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取儿茶素对照品适量，加乙腈-水（1∶9）使溶解，制成每1 mL含儿茶素176 μg的溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 药材供试品溶液的制备

刺梨：取新鲜刺梨榨汁，滤过，量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，即得刺梨供试品溶液。

金荞麦：取金荞麦药材3.3 g，加70%乙醇30 mL，回流提取两次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至约1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下静置24 h，取上清液，即得金荞麦供试品溶液。

苦参：取苦参药材1 g，加70%乙醇30 mL，回流提取两次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至约1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下静置24 h，取上清液，即得苦参供试品溶液。

2.4.2 金刺参九正合剂成品供试品溶液的制备

量取本品2 mL，置5 mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.5 方法学验证

2.5.1 精密度试验 取同一批号（批号：20080203）制剂的供试品溶液，连续进样6次进行测定，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD为0.13% ～0.77%，相对峰面积的RSD为1.92% ～2.90%，表明本方法仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取同一批号（批号：20080203）制剂的供试品溶液，分别在 0、1.5、3、6、9 h 进样，测定，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD为0.11% ～0.85%，相对峰面积的RSD为1.36% ～3.28%，没有明显变化，显示供试品溶液在9h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批号（批号：20080501）样品，按照供试品溶液的制备方法，制备5份供试品溶液，依次进行测定，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～2.48%，相对峰面积的RSD为1.23% ～2.95%，RSD<3%，表明本方法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 样品测定 取10批金刺参九正合剂样品，分别按2.4.2项下供试品溶液的制备方法进行处理，再按2.1项下条件进行HPLC指纹图谱测定。根据10批供试品溶液HPLC提供的相关参数，确定共有峰为13个，并对其进行标示。为了便于辨认和分析比较，将整个色谱图分成Ⅰ、Ⅱ两个区。指纹峰的位置：第一区包括1#～8#峰（保留时间范围3～11 min）；第二区包括9#～13#峰（保留时间范围21～42 min），见图1。相对保留时间和相对峰面积数据见表1、2。

图1 金刺参九正合剂特征指纹图谱

表1 10批样品指纹图谱共有峰的相对保留时间

表2 10批样品指纹图谱共有峰的相对峰面积

2.6.2 指纹图谱相似度计算 将10批样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版），设定匹配模板，进行谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱（见图2），进行相似度评价。样品与对照图谱的相似度，以平均数计算，分别为：0.998、0.998、0.999、0.998、0.996、0.998、0.998、0.998、0.998、0.997；以中位数计算，分别为 0.997、0.998、1.000、0.996、0.996、0.996、0.997、0.998、0.999、0.995，均大于0.99。表明10批样品与对照指纹图谱相似度良好，本制剂工艺稳定。

2.6.3 指纹图谱各共有峰归属的初步判断 精密吸取对照品溶液10 μL，药材供试品和制剂供试品溶液各7 μL分别进样，通过与指纹图谱保留时间和紫外光谱对照，确定了10号峰（S）为儿茶素。另外通过各单味药材与复方制剂指纹图谱的对照分析，基本确定了各味药材对该方的贡献。其中共有峰1#峰、8#峰来自于金荞麦药材，9#峰、13#峰来自于苦参药材，2#峰、3#峰、4#峰、7#峰来自于刺梨药材。计算各批号样品共有峰的面积，结果表明，10批供试品的共有峰面积之和均大于总峰面积的95%，结果见表3。

图2 10批金刺参九正合剂指纹图谱

2.6.4 苦参中苦参碱的含量测定 为了控制金刺参九正合剂的质量，还按照《中国药典》2005年版一部苦参项下含量测定方法对样品中苦参主要成分苦参碱的含量进行了测定，所得色谱图峰形较好，分离度高，苦参碱的含量测定结果见表4。

表3 10批金刺参九正合剂特征指纹峰的峰面积之和/%

表4 苦参碱含量测定结果

3 结论

通过上述研究确定了金刺参九正合剂供试品制备方法和色谱条件，并验证了精密度、稳定性、重复性，结果令人满意；建立了金刺参九正合剂指纹图谱，确定了其中13个主要特征峰。

13 个共有色谱峰的相对保留时间为：峰1（0.135～0.136）；峰2（0.146～0.147）；峰 3（0.165～0.166）；峰 4（0.180～0.181）；峰 5（0.234～0.237）；峰 6（0.265～0.272）；峰7（0.336～0.338）；峰 8（0.376～0.380）；峰 9（0.802～0.804）；峰10（1.000）；峰11（1.145～1.146）；峰12（1.339～1.350）；峰13（1.525～1.529）。

13 个共有色谱峰的相对峰面积为：峰1（0.555～0.660）；峰2（11.815～14.993）；峰3（1.159～1.378）；峰4（0.498～0.582）；峰 5（0.400～0.457）；峰 6（0.502～0.612）；峰7（2.739～3.248）；峰 8（0.796～0.969）；峰 9（1.367～1.792）；峰10（1.000）；峰11（1.571～1.880）；峰12（1.420～1.662）；峰13（3.810～4.605）。

根据研究结果，制定了金刺参九正合剂指纹图谱的技术参数，通过对其指纹图谱相似度的计算，10批样品的相似度都在0.99以上。因此，本方法可作为评价金刺参九正合剂质量的指纹图谱，同时为进行其物质基础研究提供了一定的实验依据。

4 讨论

4.1 流动相的选择 试验中曾选择4种流动相系统：以乙腈-水，乙腈-水-无水乙醇，乙腈-0.3%磷酸，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）进行试验。结果表明，以乙腈-水，乙腈-水-无水乙醇，乙腈-0.3%磷酸为流动相系统，供试品溶液中组分分离不理想；采用乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）体系，色谱峰尖锐无拖尾，且基线在同一趋势下重复性较好，故选择乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）系统为流动相［2］。

4.2 检测波长的选择 参考相关文献报道［3-4］，运用Agilent 1200高效液相色谱仪，二极管阵列检测器分别在210、220、230、254、280、365 nm对金刺参九正合剂主要成分吸收波长进行考察，结果在220 nm处吸收峰呈现较完全，因此确定，检测波长为220 nm。

4.3 按照国家药典委员会关于“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）的通知”，以HPLC梯度洗脱法对金刺参九正合剂进行指纹图谱研究，实验证明，该方法可操作性强，重复性好，可作为金刺参九正合剂指纹图谱研究［5］。

［1］赵新环，谢正富.苗族方药“爱福宁合剂”的抗癌作用［J］.中国民族民间医药杂志，2002，57：223-225.

［2］王欣之，文红梅，居玲玲，等.玉屏风散醇提部位HPLC指纹图谱研究［J］.中成药，2009，31（3）：335-339.

［3］何美珊，钱炳辉，王兆龙，等.金荞麦HPLC指纹图谱的研究［J］. 中国药师，2005，8（3）：217.

［4］马仁玲，周红华，于喜水，等.苦参注射液生物碱类成分指纹图谱的研究［J］. 中国中药杂志，2003，28（9）：817-819.

［5］孙守国.复方丹参片的HPLC指纹图谱研究［J］.中成药，2009，31（3）：339-342.

R284.1

A

1001-1528（2010）07-1096-03

2009-06-12

孙冬梅（1969－），女，主任中药师，主要从事中药质量评价。Tel：（020）83501292 E-mail：tcmgdp@163.com