辛伐他汀对肺纤维化大鼠肺内结缔组织生长因子表达的影响

冯彦华，肖莉，万宏光，杜妍，何颖

（中国医科大学 附属盛京医院急诊科，沈阳 110004）

肺纤维化（pulmonary fibrosis）是以成纤维细胞异常增殖、细胞外基质异常沉积为特征的慢性、进行性肺间质疾病，被诊断后中位生存期只有2～5年，传统的糖皮质激素和免疫抑制剂治疗效果并不明确［1］。肺纤维化的发病机理至今尚未明确，但已有研究显示，多种细胞因子如转化生长因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、白细胞介素13、血小板源性生长因子、干扰素γ等在肺纤维化的发病过程中起着非常重要的作用［2］，其中，CTGF作为一种重要的促纤维化性细胞因子，早已引起学术界的广泛重视。有研究表明，过度表达的CTGF可以导致动物出现轻度、一过性肺纤维化［3］。除此之外，Watts等［4］的研究证实，在CTGF促进成纤维细胞分化过程中需要信号分子RhoA的参与，而后者的转录后修饰需要胆固醇合成代谢的中间产物焦磷酸糖牛儿酯的存在，因此，胆固醇的合成受抑就有可能影响CTGF对成纤维细胞分化的调节，进而对肺纤维化进程产生抑制作用。

他汀类药物是3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMG-CoA）的抑制剂，具有明显的抑制胆固醇合成代谢的作用。近年来，陆续有学者对他汀类药物的抗纤维化作用进行了一些相关研究，发现辛伐他汀对肺成纤维细胞的预处理，不仅抑制了肺成纤维细胞RhoA活化、CTGF表达［5］，而且在一定程度上诱导成纤维细胞凋亡［6］。在这些细胞学研究的基础上，本研究建立了博来霉素气管内注射诱导的大鼠肺纤维化模型，并对大鼠进行辛伐他汀灌胃治疗，通过病理组织学、生化学等方法观察辛伐他汀对大鼠肺纤维化的治疗作用，并通过免疫组化和光密度分析观察辛伐他汀对纤维化大鼠肺组织CTGF表达所产生的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～210 g）由中国医科大学实验动物中心提供，博来霉素（Bleomycin，BLM）系日本化药株式会社产品，辛伐他汀（舒降之）为杭州默沙东公司出品。Massion染色试剂盒购于广州俪科公司，羟脯氨酸含量测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，CTGF抗体、生物素标记二抗、SABC试剂盒和DAB显色试剂盒均为博士德生物工程有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和实验设计：SD大鼠60只，随机分为 4组：盐水对照组（control group）、模型组（model group）、辛伐他汀即刻治疗组（immediately simvastatin group）和辛伐他汀7 d后治疗组（delayed simvastatin group）。实验设计如下：模型组、辛伐他汀即刻治疗组和辛伐他汀7 d后治疗组均于水合氯醛（10%，0.3 g/kg）腹腔麻醉后气管内一次性注射博来霉素5 mg/kg复制肺纤维化模型，盐水对照组气管内注入等容积的生理盐水。建模后当日，辛伐他汀即刻治疗组每日胃管内注入辛伐他汀生理盐水混悬液20 mg/kg；盐水对照组、模型组每日胃管内注入等容积的生理盐水；辛伐他汀7 d后治疗组于建模7 d内每日胃管内注入等容积的生理盐水，7 d后改为每日胃管内注入辛伐他汀生理盐水混悬液20 mg/kg。各组动物均于建模7 d、14 d和28 d后各处死5只，观察肺组织病理学改变、羟脯氨酸含量变化以及肺组织CTGF的表达。

1.2.2 肺组织病理学观察：取右肺下叶，4%中性福尔马林固定后，按常规病理学方法脱水、包埋、切片、HE染色、Masson染色。

1.2.3 肺组织羟脯氨酸含量测定：按羟脯氨酸含量测定试剂盒的操作步骤，称量左肺组织30~50 mg，加入水解液1 ml进行样本水解，之后加入pH甲液、乙液调节pH值至6.0～6.8，活性炭吸附后离心，提取上清液1ml后测定各样本吸光度。

1.2.4 肺组织CTGF的表达：按博士德公司SABC免疫组化染色试剂盒使用说明书进行操作，用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液进行热抗原修复，DAB显色液显色，阴性对照以PBS代替一抗。CTGF阳性细胞表现为细胞浆内有棕褐色颗粒沉积，阴性对照则无。每张切片随机选取10个无重叠400倍高倍视野，应用NIS-Elements F2.30图像采集软件进行图像采集，NIS-Elements BR3.0图像分析软件计算平均光密度（mean optical density，MOD），以 MOD 作为 CTGF表达的半定量参数。

1.3 统计学分析

所有数据均为计量资料，以x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，有显著性差异者进一步用Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。P<0.05作为具有统计学差异标准，P<0.01为具有统计学极显著差异标准。统计分析采用SPSS 10.0统计软件完成。

2 结果

2.1 辛伐他汀对肺纤维化大鼠肺组织病理学改变的影响

2.1.1 肺组织HE染色：盐水对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡腔大小均匀、无明显炎性细胞浸润，肺泡间隔无增厚，无明显纤维组织增生。模型组大鼠7 d时肺泡腔内可见大量中性粒细胞浸润，肺泡间隔胶原纤维增生少见；14 d时肺泡腔内炎性细胞明显减少，间隔内胶原纤维明显增生；28 d时大量肺泡结构破坏、萎陷，胶原纤维广泛增生，偶见肺泡腔代偿性扩张。与模型组相比，辛伐他汀即刻治疗组和辛伐他汀7 d后治疗组7 d时病理表现差异不明显；14 d时中性粒细胞浸润较少，部分肺泡间隔纤维组织轻度增生；28 d时部分肺泡间隔内胶原纤维增生，周围可见较多量正常肺泡（图1）。

2.1.2 肺组织Masson染色：盐水对照组肺泡周围可见少量蓝染的胶原纤维。模型组大鼠14 d时胶原纤维明显增生，28 d时可见蓝染的胶原纤维广泛大量增生，肺泡结构破坏。辛伐他汀即刻治疗组和辛伐他汀7 d后治疗组胶原纤维轻-中度增生，较模型组增生程度明显减轻（见图2）。

2.2 辛伐他汀治疗对肺纤维化大鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响

气管内滴注博来霉素后，模型组大鼠肺组织羟脯氨酸含量逐渐增高，与对照组相比有统计学意义；在28 d时，辛伐他汀即刻治疗组、辛伐他汀7 d后治疗组肺组织羟脯氨酸含量，均明显低于模型组并有统计学意义，提示无论是辛伐他汀的即刻治疗还是7 d后的延迟治疗，均可对纤维化大鼠的肺组织胶原纤维形成产生有效的抑制作用（表1）。

2.3 辛伐他汀对肺纤维化大鼠肺组织CTGF表达的影响

CTGF的免疫组化和光密度分析结果显示：气管内滴注博来霉素后，模型组大鼠肺组织CTGF的表达在7 d时达峰，并在之后的28 d内维持在较高水平；在14 d、28 d时，辛伐他汀即刻治疗组、辛伐他汀7 d后治疗组肺组织CTGF表达，均明显低于模型组并有统计学意义，提示无论是辛伐他汀的即刻治疗还是7 d后的延迟治疗，均可对纤维化大鼠的肺组织CTGF表达产生有效的抑制作用（表1，图3）。

表1 气管内滴注BLM后各组大鼠肺组织羟脯氨酸含量和CTGF平均光密度的变化（x±s）Tab.1 Changes of the hydroxyproline content and the MOD of CTGF in rat lungs after intratracheal BLM instillation（x±s）

3 讨论

博来霉素气管内滴注复制的肺纤维化模型被认为是研究肺纤维化的经典模型，应用最为广泛［7］。气管内滴注博来霉素后，肺组织早期以肺泡炎为主，肺泡腔和肺泡间隔出现大量炎性细胞浸润，大约在9 d左右［8］，肺泡炎开始向纤维化转变，并在3~4周后形成弥漫纤维化：肺泡结构广泛破坏、肺泡腔萎陷、甚至消失，肺泡间隔增宽，肺间质内出现大量胶原纤维和成纤维细胞。本研究模型组大鼠的肺组织病理改变和羟脯氨酸含量测定结果与上述变化基本一致，标志建模成功。

CTGF是一种富含半胱氨酸的多肽，分子量为38 kDa，于1991年在人脐静脉内皮细胞的条件培养液中被发现［9］。CTGF可被TGF-β、凝血酶等多种促纤维化介质所诱导，对于成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和细胞外基质的分泌起着非常重要的作用［10，11］。Lasky等［12］发现，在博来霉素诱导的纤维化肺组织中，CTGF的表达明显增高。与此相一致的是，Allen等［13］在特发性肺纤维化患者的肺组织和支气管肺泡灌洗液的细胞内也发现表达异常增高的CTGF。本研究结果与此相似，气管内滴注博来霉素后，大鼠肺组织CTGF表达明显增高，在1周左右达峰，之后持续高表达水平。

辛伐他汀是一种常用的他汀类降脂药，作用肯定，疗效安全。已有研究证实，辛伐他汀对肺成纤维细胞的预处理，不仅抑制了CTGF的基础活性，也抑制了TGF-β对CTGF活性的诱导，该作用依赖于辛伐他汀对信号分子RhoA转录后修饰的抑制。Burke等［14］人的研究发现，TGF-β1介导了成纤维细胞 Smad2/3的磷酸化、CTGF和胶原蛋白Iα-2的合成以及1型纤溶酶原激活物抑制物的激活，并最终诱导了成纤维细胞活化，而辛伐他汀对成纤维细胞的预处理，对TGF-β1所介导的上述多种致纤维化作用均产生有效抑制。本研究结果表明，气管内滴注博来霉素后对大鼠进行辛伐他汀治疗，抑制了纤维化肺组织CTGF的高表达，降低了肺组织羟脯氨酸含量，并改善了肺组织的纤维化病理改变。

除此之外，本研究尚证实了辛伐他汀的延迟治疗作用。Moeller等［15］认为，在博来霉素建模7 d内进行药物治疗，只能被称为“预防性疗法”；只有在博来霉素建模7 d后进行药物治疗，才能被称为“治疗性疗法”。这是因为前者的“抗纤维化”疗效，有可能源于其对起始阶段炎症和早期纤维化反应的干扰，而在肺纤维化反应已经始动并进行性加重阶段，该种药物能否缓解纤维化损害，仍存在疑问。因此，“治疗性疗法”更具有研究价值。本研究提示，在博来霉素气管内滴注7 d后给药，辛伐他汀仍能有效抑制纤维化肺组织CTGF的高表达，降低肺组织羟脯氨酸含量，改善肺组织的纤维化病理改变，进一步肯定了辛伐他汀对肺纤维化的抑制作用。

总之，本研究结果显示，在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化过程中，辛伐他汀有效抑制了肺组织CTGF高表达，改善肺组织纤维化程度，证实了辛伐他汀的延迟治疗作用，为辛伐他汀治疗肺纤维化提供新的理论依据。

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